犬阴道微生物组研究标准化方法的评估：存储条件、宿主DNA去除及数据库选择的影响

（编辑推荐）本研究通过评估样本存储方式（eNAT培养基 vs 无培养基）、宿主DNA去除（benzonase处理）及参考数据库（Emu vs SILVA）对犬阴道微生物组测序结果的影响，首次提出标准化研究流程。结果显示数据库选择显著影响β多样性（PERMANOVA P<0.05），而存储条件和宿主DNA去除对微生物组成无显著差异（Wilcoxon P>0.05），为低生物量样本（DNA浓度0.0352-4.49 ng/μL）的NGS研究提供方法论基础。

　　

微生物组研究的方法学挑战

犬类阴道微生物组研究长期面临方法学标准化缺失的困境。与人类阴道微生物组（以乳酸杆菌为主导）不同，犬阴道呈现更高多样性，主要菌群包括卟啉单胞菌（Porphyromonas，25.8%）、微小单胞菌（Parvimonas，23.1%）和梭杆菌（Fusobacterium，10.7%）。这种低生物量环境（DNA浓度0.0352-4.49 ng/μL）对采样和测序技术提出特殊要求。

双保护拭子系统的创新应用

研究团队改良马用双保护拭子（Continental Plastic Corp.）结合FLOQSwab（Copan），通过无菌操作采集颅侧阴道样本。相比既往使用棉签或无保护措施的方法，该技术有效避免外阴和尾侧阴道污染。阴性对照显示污染菌（主要为厚壁菌门Firmicutes 74%）占比不足1%，证实该方法可靠性。

存储条件的科学验证

比较eNAT核酸稳定介质与普通离心管（Eppendorf）存储效果，发现：

• DNA浓度无显著差异（Wilcoxon P=0.917）
• α多样性指标（Chao1/Shannon指数）和β多样性（Bray-Curtis/UniFrac）均未受影响（PERMANOVA P>0.05）
  eNAT介质因内置裂解细胞功能且支持无菌折断设计，被推荐为首选存储方案。

宿主DNA去除的争议澄清

采用苯甲酸酶（benzonase）处理进行宿主DNA去除后：

• 未显著改变革兰阴性菌比例（如大肠杆菌Escherichia coli仅占0.12-0.19%）
• LEfSe分析未发现任何菌种存在组间差异（LDA log score >2.0）
  这与人类研究中观察到的革兰阴性菌偏倚现象形成对比，可能源于酶处理温和性差异。

数据库选择的蝴蝶效应

牛津纳米孔全长度16S rRNA测序（V1-V9）结合不同数据库分析显示：

• SILVA数据库检出更多分类单元（262种vs Emu的211种），但61%无法鉴定到种级
• Emu实现100%种级分辨率，如将SILVA报告的Parvimonas sp.精确鉴定为微小微小单胞菌（P. micra）
• β多样性呈现显著差异（PERMANOVA P<0.05），凸显数据库选择对跨研究比较的关键影响

标准化路线图的提出

基于证据链，研究推荐：

1. 采样：双保护拭子+无菌手套
2. 存储：优先选用eNAT介质
3. 测序：牛津纳米孔全长度16S rRNA
4. 分析：SILVA用于广谱分类，Emu辅助种级鉴定
   该框架为探索犬生殖健康（如不孕症、子宫蓄脓）的微生物标志物奠定方法学基础，未来可扩展至病毒和真菌组研究。

研究局限与展望

当前样本量（6只发情期犬）和存储时长（仅-80°C）存在局限。阴性对照数量不足限制去污染算法应用，建议后续研究增加：

• 多时间点存储评估
• 跨DNA提取试剂盒比较
• 人工mock community验证