基于扩增子测序的环境样本中伤寒沙门氏菌基因分型与耐药性检测新策略

这篇研究创新性地开发了针对环境样本（如废水）中伤寒沙门氏菌（S. Typhi）的多重靶向扩增子测序方案，通过牛津纳米孔技术（ONT）MinION平台实现对菌株基因型（如H58亚型4.3.1）和耐药基因（如gyrA-S83Y突变）的同步检测。该方法突破了传统临床监测的局限性，为低收入地区伤寒热负担评估和公共卫生干预（如疫苗接种和抗生素使用策略）提供了高灵敏度的环境监测工具。

　　

背景与方法革新
伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhi）是伤寒热的主要病原体，全球年发病约900万例。传统临床监测依赖血培养（灵敏度40-80%）和分子检测，但受限于医疗资源与患者就诊率。本研究提出环境监测（ES）新策略，通过检测废水中S. Typhi的DNA，结合靶向扩增子测序技术，突破培养依赖的限制。团队设计了包含18个SNP位点的多重PCR引物组，覆盖基因分型（如4.3.1.1亚型）和耐药相关突变（如gyrA和acrB基因），采用牛津纳米孔技术（ONT）MinION进行测序，并通过GenoTyphi流程解析数据。

实验设计与样本验证
研究分两阶段测试：

1. 对照验证：使用英国卫生安全局（UKHSA）提供的3株S. Typhi（包括H58谱系菌株），证实引物组可准确识别基因型（如4.3.1.1）和质粒介导的多重耐药性（如PST6）。
2. 实地应用：分析印度韦洛尔110份废水样本（医院与社区来源），通过三重qPCR（靶向ttr/tviB/staG基因）预筛后，8份样本成功获得基因型与AMR信息。例如，医院样本Hospital-4检出4.3.1.1亚型及gyrA-S83F突变，与同期临床分离株匹配。

技术挑战与优化方向
尽管取得突破，方法仍面临灵敏度问题：

• 非特异性扩增：约68%的读长映射至非目标菌（如肠杆菌属），主因引物交叉结合。
• 读长分布不均：Pool A（靶向罕见SNP）覆盖率不足，建议缩短扩增子或引入预富集步骤。
• 样本处理差异：BMFS（6.5L）与膜过滤（2.5L）的回收率差异显著，需标准化流程。

公共卫生应用前景
该技术为资源有限地区提供替代监测方案，其优势包括：

1. 成本效益：纳米孔测序设备便携且维护简单。
2. 耐药监测：检出染色体突变（如parC-E84K）和质粒基因（如IncHI1），指导抗生素使用。
3. 扩展潜力：可适配其他病原体（如副伤寒沙门氏菌）的SNP分型。

未来需优化引物特异性、扩大参考基因组库，并通过多中心验证提升可靠性。这项技术有望成为伤寒热防控的新基石，尤其在缺乏临床监测的地区。