TGF-β1/IFN-γ双重许可的人骨髓间充质基质细胞外囊泡的免疫调节作用：从分子机制到治疗潜力

本研究针对炎症性疾病治疗中细胞疗法的局限性，探索了TGF-β1/IFN-γ双重许可的人骨髓间充质基质细胞（MSCs）来源的小细胞外囊泡（EVs）的免疫调节功能。通过体外THP-1巨噬细胞极化模型和PBMC共培养实验，发现许可EVs能显著抑制促炎因子TNF-α/IL-1β分泌、促进抗炎表型转化，并通过上调PD-L1和CD73增强Treg细胞诱导能力。t-SNE分析揭示了独特的免疫调节特征，转录组数据鉴定出GPR68/LIMK2等7个关键差异基因，为开发无细胞免疫疗法提供了新策略。

　　

在免疫相关疾病治疗领域，间充质基质细胞（MSCs）因其强大的免疫调节能力被视为革命性疗法。然而，细胞治疗存在存活率低、致瘤风险等瓶颈问题。更棘手的是，未经处理的MSCs在炎症微环境中可能表现出疗效不稳定。这促使科学家将目光转向MSCs分泌的细胞外囊泡（EVs）——这些纳米级“分子邮包”携带母细胞的功能性物质，却规避了细胞移植的缺陷。但普通EVs的免疫调节效力是否足以满足临床需求？如何进一步提升其治疗效果？

爱尔兰高威大学（University of Galway）再生医学研究所的研究团队在《Stem Cell Research & Therapy》发表的研究给出了创新解决方案。他们采用转化生长因子-β1（TGF-β1）和干扰素-γ（IFN-γ）双重细胞因子预刺激（licensing）人骨髓MSCs，通过尺寸排阻色谱法分离小EVs，综合运用纳米颗粒追踪分析（NTA）、流式细胞术和透射电镜（TEM）进行表征。在THP-1巨噬细胞极化模型和PBMC共培养体系中，结合t-SNE降维分析和公共转录组数据挖掘，系统评估了许可EVs的免疫调节特性并探索其分子机制。

关键实验方法
研究使用健康供者骨髓来源的MSCs，经TGF-β1（50 ng/mL）和IFN-γ（50 ng/mL）双重刺激72小时后收集条件培养基。通过差速离心结合qEV 35 nm色谱柱分离EVs，采用NTA检测粒径分布（78.8-86.3 nm），流式验证CD9/CD63/CD81阳性率（54-81%）。功能实验包括：①THP-1巨噬细胞极化实验（检测CD163/CD206、IL-1β/TNF-α/IL-10和NO水平）；②PBMC增殖抑制实验（CellTrace染色）；③Treg诱导分析（CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺）；④t-SNE/DBSCAN聚类算法处理多参数流式数据；⑤整合GSE122091/GSE46019数据集筛选差异基因。

研究结果

1. EVs表征
   

   
   
   NTA显示许可EVs粒径（86.3 nm vs 78.8 nm）和浓度（3.79×10¹⁰/mL vs 1.42×10¹⁰/mL）显著增加，TEM证实其典型双层膜结构。流式检测显示CD9/CD63/CD81阳性率提升15-25%，提示细胞因子刺激改变了EVs的生物发生过程。

2. 巨噬细胞极化调控
   

   
   
   在5×10⁸ particles/mL剂量下，许可EVs使IL-10分泌量较对照组增加3.2倍（p<0.001），NO水平降低42%。虽然CD163/CD206上调无组间差异，但促炎因子TNF-α/IL-1β呈现下降趋势，显示其通过多途径重塑巨噬细胞表型。

3. T细胞免疫调节
   

   
   
   许可EVs使CD3⁺ T细胞增殖率降低58%（p<0.01），PD-L1表达提升4.7倍（p<0.001）。CD73上调虽无统计学差异，但腺苷通路可能协同增强免疫抑制。

4. Treg诱导特征
   

   
   
   t-SNE聚类识别出5个亚群，其中Cluster 3（高表达CD4/CD25/FOXP3的非增殖Treg）在许可EVs组占比达21.3%，显著高于对照组（9.8%）和普通EVs组（12.1%）。值得注意的是，78%的Treg来源于静息T细胞直接分化而非增殖扩增。

5. 分子机制探索
   转录组分析发现GPR68（酸敏感受体）、LIMK2（细胞骨架调节因子）和LIPG（脂代谢酶）在两种许可条件下均上调，而EFNA5（轴突导向分子）等4个基因下调。这些基因可能通过调控EVs的货物分选（如LIMK2影响多泡体-膜融合）或免疫微环境感知（如GPR68）增强EVs功能。

结论与意义
该研究首次证实TGF-β1/IFN-γ双重许可策略可显著提升MSC-EVs的免疫调节效能，其作用特点包括：①剂量依赖性抑制先天/适应性免疫；②通过非增殖途径诱导功能性Treg；③形成独特的PD-L1^high/CD73⁺免疫调节特征。发现的7个核心差异基因为质量标志物筛选提供了新靶点。相较于传统MSC疗法，这种无细胞策略具有稳定性高、易标准化生产等优势，在自身免疫病（如类风湿关节炎）和移植排斥防治中展现广阔前景。未来需在动物模型中验证其体内效果，并探索关键分子（如LIPG修饰的脂质体）的工程化应用可能。