解淀粉芽孢杆菌孢子展示非洲猪瘟关键抗原：一种潜在口服疫苗候选物的开发与免疫评价

本研究针对非洲猪瘟病毒(ASFV)缺乏有效疫苗的难题，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了表达ASFV关键抗原p72和p30/p54的解淀粉芽孢杆菌孢子载体。研究证实重组孢子能诱导小鼠产生高水平特异性抗体（IgG）、促进脾淋巴细胞增殖（LPI>100%）并激活T/B细胞亚群（CD3+CD4+/CD8+和B220+CD19+），为开发安全高效的口服ASF疫苗提供了新策略。

　　

非洲猪瘟(ASF)作为全球养猪业的"头号杀手"，其病毒(ASFV)致死率可达100%，但传统灭活疫苗无法诱导细胞免疫，减毒活疫苗又存在生物安全风险。面对这一困境，淮阴工学院江苏省益生菌制备重点实验室与江苏省农业科学院兽医研究所的研究人员另辟蹊径，利用解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)孢子的独特优势——耐胃酸、能定植肠道、具有多种衣壳蛋白锚定位点，开发了一种创新的口服疫苗载体系统。相关成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》上，为ASF防控提供了全新解决方案。

研究团队采用CRISPR-Cas9基因编辑系统，将ASFV的p72抗原与孢子衣壳蛋白CotB融合，p30/p54融合抗原与CotG融合，成功构建重组菌株△Ba72和△Ba3054。通过Western blot和免疫荧光证实抗原在孢子表面高效表达（p72达7μg/g孢子，p3054达17μg/g孢子）。动物实验采用BALB/c小鼠模型，通过三次口服免疫（4.5×10⁹孢子/次）评估免疫效果。

主要结果

1. 抗原表达验证：免疫荧光显示重组孢子表面呈现明显橙色（△Ba72）和绿色荧光（△Ba3054），而野生型孢子无信号。Western blot检测到预期大小的融合蛋白（CotB-p72约104 kDa，CotG-p3054约62 kDa）。

2. 体液免疫应答：ELISA显示△Ba72组抗p72 IgG抗体水平较对照组提高3.2倍（p<0.05），△Ba3054组抗p30抗体提高2.8倍。值得注意的是，1:1混合孢子（△Ba72+3054）可同时诱导两种抗体，且无交叉抑制。

3. 细胞免疫激活：

   • 脾淋巴细胞增殖指数（LPI）在p72刺激下，△Ba72组达158%，显著高于野生孢子组（100%）。
   • 细胞因子检测显示△Ba72+3054组IFN-γ分泌量较对照组提高4.5倍，IL-4提高3.1倍。
   • 流式细胞术证实重组孢子能显著增加CD3⁺CD4⁺（+32%）、CD3⁺CD8⁺（+28%）T细胞和B220⁺CD19⁺ B细胞（+41%）比例。

技术亮点
研究建立了无抗性标记的孢子表面展示系统：①基于p43强启动子驱动Cas9表达；②利用温度敏感型质粒实现基因编辑；③通过CotB/CotG定向展示多抗原；④采用口服途径评估黏膜免疫效果。

结论与意义
该研究首次实现ASFV多抗原在解淀粉芽孢杆菌孢子表面的协同展示，证实口服接种可同时激活体液和细胞免疫。特别是混合孢子疫苗的"1+1>2"效应，为多价疫苗开发提供了新思路。相比传统注射疫苗，孢子疫苗具有成本低（无需纯化）、易储存（耐高温）、使用便捷（可拌料投喂）等优势，更适用于养殖场大规模免疫。未来通过优化抗原组合（如加入CD2v蛋白）及猪体试验，有望推动首个ASF口服疫苗的产业化应用。