基于LC-MS的简化方法结合体外代谢模型实现DNA加合物的高灵敏度分析与结构解析

本研究针对传统DNA加合物分析方法在结构信息获取和代谢激活系统选择上的局限性，开发了一种结合HepG2细胞与肝脏S9组分的LC-MS/MS工作流程。研究人员通过β-萘黄酮诱导优化代谢活性，首次在非转染癌细胞中检测到苯丙素类化合物的DNA加合物，为未知加合物的发现提供了高效平台。该方法在黄曲霉毒素B1、苯并[a]芘等六类致癌物的检测中展现出优于原代肝细胞的性能。

　　

生命的遗传密码存储在DNA的精密结构中，但无处不在的化学物质可能通过形成DNA加合物破坏这种稳定性。传统32P后标记法等技术虽能检测DNA损伤，却像"盲人摸象"般无法揭示加合物的化学结构。更棘手的是，大多数致癌物需要经过细胞色素P450(CYP)等代谢酶的活化才能与DNA结合，这使得研究中选择合适的生物模型成为关键挑战。现有方法要么缺乏结构解析能力，要么受限于原代肝细胞获取困难、代谢活性不足等问题，严重阻碍了新型DNA加合物的发现与研究。

针对这些瓶颈，德国明斯特大学(University of Münster)的Andrea Gerdemann团队开发了一种创新的解决方案。研究人员将高灵敏度液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)与易获取的体外代谢模型相结合，建立了一套能同时实现结构解析和高通量检测的工作流程。这项突破性研究发表在毒理学权威期刊《Archives of Toxicology》上，为DNA加合物研究提供了新的方法论支持。

研究采用三种关键技术：1)通过β-萘黄酮(β-NF)诱导增强HepG2细胞的CYP1A1/2表达；2)优化基于相分离原理的DNA提取流程，避免不稳定加合物(如N-7鸟嘌呤加合物)降解；3)运用高分辨质谱(HRMS)的非靶向分析与多反应监测(MRM)靶向分析相结合的策略，利用中性丢失116 Da(脱氧核糖)等特征碎片鉴定未知加合物。

【代谢在癌细胞系中的优化】
通过β-NF预处理显著提升HepG2细胞代谢能力，10 μM处理使黄曲霉毒素B₁(AFB₁)加合物形成量增加4倍。比较三种癌细胞系发现，肝源性的HepG2细胞对AFB₁的代谢活化能力显著优于肺腺癌A549和结肠癌HT-29细胞，证实其作为代谢研究模型的优越性。

【不同生物系统的比较】
在六类代表性致癌物测试中，肝脏S9组分展现出最强的加合物形成能力，而HepG2细胞在苯并[a]芘(B[a]P)代谢中甚至超越原代肝细胞。特别值得注意的是：

1. 3-单氯丙二醇(3-MCPD)在S9系统中首次被证实通过环氧丙醇中间体形成鸟嘌呤加合物；
2. α/β-细辛醚在非转染HepG2细胞中首次检测到脱氧腺苷加合物，揭示苯丙素类化合物的基因毒性风险；
3. 甲基丁香酚(ME)通过独特的磺酸化-脱磺酸化两步活化途径形成加合物，在细胞系统中产量更高。

这项研究建立的"先S9筛查后细胞验证"策略具有重要方法论意义。肝脏S9组分凭借其高代谢活性和简单制备流程，成为未知加合物筛查的理想平台；而经β-NF诱导的HepG2细胞则平衡了代谢能力与生理相关性，特别适合研究涉及多步活化或DNA修复的加合物动力学。研究不仅首次在非转染癌细胞中证实了苯丙素类化合物的DNA结合能力，还为3-MCPD等争议性物质的基因毒性机制提供了新证据。

该工作流程的普适性在六类结构迥异的致癌物测试中得到验证，其"结构解析+代谢模拟"的双重优势将显著加速新型环境致癌物的发现与风险评估。未来，结合转录组学分析β-NF诱导的代谢通路变化，或可进一步优化细胞模型对不同类型前致癌物的代谢覆盖范围。这项研究为食品安全和药物开发领域的遗传毒性评价提供了可靠且易推广的技术方案。