组蛋白和PARP1上的丝氨酸ADP核糖基化是酯键泛素化的细胞靶点

研究人员发现组蛋白和PARP1上的丝氨酸ADP核糖基化(Ser-ADPr)可作为酯键泛素化的新型靶点。通过开发基于RNF114锌指结构域(ZUD)的特异性富集策略和质谱分析方法，首次在细胞中鉴定出ADP核糖基-泛素化修饰位点，揭示了PARP1信号通路中这种复合翻译后修饰的生物学功能，为理解ADPr与泛素化交叉调控提供了新视角。

　　

在细胞信号传导的复杂网络中，翻译后修饰(PTM)如同精密的分子开关，调控着各种生命活动。其中，ADP核糖基化(ADPr)和泛素化作为两种重要的PTM，它们的交互作用日益受到关注。然而，由于技术限制，ADPr与泛素化直接结合的化学形式——特别是酯键连接的ADP核糖基-泛素化修饰——在细胞内的存在和功能一直是个未解之谜。德国马克斯普朗克衰老研究所(Max Planck Institute for Biology of Ageing)的研究团队在《Nature Chemical Biology》发表的重要研究，首次在细胞中鉴定出这种复合修饰的具体位点，揭示了其在DNA损伤应答中的关键作用。

研究人员采用多组学联用策略开展研究：1) 构建RNF114锌指-UIM结构域(ZUD)的特异性富集系统；2) 开发基于EDTA化学洗脱的靶向富集技术；3) 建立腺嘌呤触发-电子转移解离(ETD)的多级质谱分析方法；4) 利用SpyTag-SpyCatcher蛋白连接技术构建模块化检测试剂。这些创新方法克服了酯键不稳定的技术难题。

结果

Mono-ADPr-dependent interactome of RNF114

通过诱导表达GFP标记的RNF114野生型(WT)和C176A突变体，结合定量蛋白质组学分析，鉴定出PARP1、XRCC1等DNA修复蛋白以及去泛素化酶作为RNF114的相互作用蛋白，这些相互作用依赖于其zfDi19结构域对单ADP核糖基化(mono-ADPr)的识别能力。

Identification of peptides comodified by ubiquitin and ADPr

对已发表数据集进行重新分析，发现组蛋白肽段上存在相邻修饰模式：ADP核糖基化丝氨酸(Ser-ADPr)与紧邻上游赖氨酸的泛素化(GlyGly)共存，提示两种PTM的空间协同调控。

Identification of ADP-ribosyl-ubiquitylation sites using ZUD

开发基于ZUD结构域的富集策略，结合特异性EDTA洗脱和酸性ArgC/LysC酶解方案，在ARH3敲除细胞中鉴定出PARP1 S499/S519、组蛋白H3 S10/S28和H2B S6等多个ADP核糖基-泛素化位点。质谱图谱显示特征性诊断离子：ADP-GlyGly(m/z 542.079)、AMP-GlyGly(m/z 462.113)和腺苷-GlyGly(m/z 364.136)。

A double-triggering MS strategy

设计腺嘌呤触发-二级质谱验证的多级分析方法：先通过快速HCD检测腺嘌呤离子(m/z 136.061)，再触发高精度ETD/HCD扫描确认ADP核糖基-泛素化特征峰，显著提高了低丰度修饰肽段的检测灵敏度。

Conversion of ZUD into a modular reagent

利用SpyTag技术将ZUD改造为二聚化检测试剂，通过免疫印迹证实羟基胺敏感性的ADP核糖基-泛素化信号。该信号在DNA损伤条件下显著增强，并可被PARP抑制剂olaparib抑制，证实其依赖PARP1-HPF1介导的Ser-ADPr。

这项研究首次在细胞中证实ADP核糖基-泛素化是一种内源性的丝氨酸翻译后修饰，拓展了对PARP1信号"第二波"——即单ADP核糖基化下游事件的认识。所开发的ZUD富集策略和模块化检测工具为研究这类复合PTM提供了通用平台。更重要的是，该发现揭示了ADPr与泛素系统在DNA损伤应答中的直接化学对话，为理解PTM网络调控提供了新范式。由于RNF114也参与干扰素信号等通路，这一发现可能具有更广泛的生物学意义，为相关疾病治疗靶点的开发奠定基础。