纳米孔测序与短读长RNA测序联合分析揭示METTL3-m6A修饰在内分泌治疗敏感和耐药乳腺癌细胞中的失调机制

本研究通过整合纳米孔直接RNA测序(DRS)和短读长Illumina RNA测序技术，揭示了METTL3介导的m6A RNA甲基化修饰在乳腺癌内分泌治疗(ET)耐药中的关键作用。研究人员在ET敏感型MCF-7和耐药型LCC9细胞中鉴定出PDIA6、EEF1A2等关键基因的m6A修饰差异，并发现m6A位点与ERα mRNA结合位点的空间邻近性，为理解ET耐药机制提供了新视角。

　　

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，其中约70%病例表现为雌激素受体α(ERα)阳性。虽然内分泌治疗(Endocrine Therapy, ET)是ERα阳性乳腺癌的主要治疗手段，但获得性耐药问题严重制约了临床疗效。近年来，RNA表观遗传修饰特别是N⁶-甲基腺苷(m⁶A)修饰在肿瘤发生发展中的作用日益受到关注，但其在乳腺癌ET耐药中的具体机制尚不明确。

美国路易斯维尔大学医学院生物化学与分子遗传学系的研究人员针对这一科学问题，创新性地采用纳米孔直接RNA测序(DRS)结合Illumina短读长RNA测序技术，系统研究了ET敏感型MCF-7和耐药型LCC9乳腺癌细胞的m⁶A修饰图谱。研究发现发表于《Functional 》期刊，为理解ET耐药的表观转录组调控机制提供了重要线索。

研究团队运用了多项关键技术：1)纳米孔MinION直接RNA测序(DRS)进行单碱基分辨率m⁶A检测；2)Illumina短读长RNA测序分析差异表达基因(DEG)；3)m⁶A甲基化免疫沉淀-qPCR(MeRIP-qPCR)验证关键位点；4)机器学习算法m6Anet进行m⁶A位点预测；5)双荧光素酶报告基因系统评估m⁶A对AMIGO2基因表达的调控作用。

【m⁶A检测与定量工作流程】
研究人员建立了完整的m⁶A分析流程，通过m6Anet算法识别高置信度m⁶A位点，结合广义线性模型进行差异修饰分析。在LCC9与MCF-7细胞比较中，鉴定出84个显著差异的m⁶A位点，主要分布在3'UTR区域。染色体分析显示17号和19号染色体m⁶A修饰密度最高。

【DEGs与差异m⁶A修饰基因的整合分析】
通过整合分析发现74个同时具有差异表达和差异m⁶A修饰的基因，包括PDIA6、ACTB、EEF1A2和FLNA等。其中PDIA6在耐药细胞中表达上调且m⁶A修饰增加，而ACTB和EEF1A2则呈现相反趋势。这些基因与细胞粘附、免疫信号等ET耐药相关通路密切相关。

【METTL3抑制对基因表达和m⁶A修饰的影响】
使用选择性METTL3抑制剂STM2457处理细胞后，发现AMIGO2、CITED4等基因表达显著改变。特别值得注意的是，AMIGO2的m⁶A修饰减少导致其mRNA稳定性增加，这一现象通过报告基因实验和METTL3过表达/敲低实验得到验证。

【m⁶A修饰与ERα mRNA结合位点的空间关系】
研究发现m⁶A位点与ERα结合位点存在空间邻近性，在耐药细胞中尤为显著。例如ACTB、PDIA6和XBP1等基因的m⁶A位点位于ERα结合位点100bp范围内，提示m⁶A可能通过影响RNA-蛋白质相互作用参与ET耐药调控。

这项研究首次系统描绘了乳腺癌ET耐药细胞的m⁶A修饰图谱，建立了整合纳米孔DRS和RNA-seq的数据分析框架。研究发现METTL3通过动态调控关键基因的m⁶A修饰影响其表达水平，进而参与ET耐药过程。特别值得注意的是，m⁶A修饰与ERα RNA结合位点的空间关联为理解激素受体信号通路的表观转录调控提供了新视角。该研究不仅为乳腺癌ET耐药机制提供了新的理论基础，也为开发靶向RNA修饰的治疗策略指明了方向。未来研究可进一步探索特定m⁶A位点的功能验证及其在临床样本中的转化应用价值。