H3N2流感病毒在人源肺细胞与巨噬细胞中引发差异先天免疫应答的转录组学解析

本研究针对流感病毒感染早期宿主先天免疫应答的分子机制不清问题，由维尔茨堡大学等机构联合开展H3N2感染人肺腺癌（A549）和人单核（THP-1）细胞的时序转录组分析。通过RNA测序（RNA-seq）揭示两类细胞在4-24小时感染窗口期的差异基因表达谱，发现肺上皮细胞与巨噬细胞激活截然不同的免疫通路网络。该数据集（GSE169309）为解析流感免疫病理机制提供了关键分子资源，支持跨物种呼吸道病毒感染研究的比较分析。

　　

流感病毒每年在全球造成数百万重症病例和数十万死亡，其致命性不仅源于病毒直接损伤，更与宿主过激的先天免疫应答引发的"细胞因子风暴"密切相关。在感染早期，肺上皮细胞作为病毒入侵门户，与肺泡巨噬细胞共同构成第一道防线。然而由于人类组织样本获取困难，当前对这两类关键细胞在分子水平的应答机制认知存在空白。传统临床研究仅能通过血液或支气管肺泡灌洗液间接分析，无法揭示感染灶核心的细胞特异性反应网络。

为解决这一瓶颈，德国维尔茨堡大学感染生物学研究所联合多家机构，在《BMC Genomic Data》发表最新研究。团队利用人肺腺癌细胞（A549）和经PMA诱导分化的巨噬细胞样THP-1细胞，以严格质控的H3N2流感病毒（A/Panama/2007/99株）进行时序感染实验，通过高通量转录组测序绘制了0-24小时宿主应答动态图谱。研究首次在相同实验条件下平行比较两类细胞的分子应答差异，建立了可公开获取的标准化数据集（GEO: GSE169309），为解析流感免疫病理机制提供了全新视角。

关键技术方法

研究采用标准化感染流程：A549细胞以感染复数（MOI=1）、THP-1细胞以MOI=0.1接种H3N2病毒，在含TPCK-胰酶的培养基中培养，分别于4/8/24小时（A549）和4/8/12/24小时（THP-1）收取样本。通过miRNeasy试剂盒提取总RNA，经Agilent 2100生物分析仪质检合格后，采用NEB定向RNA文库构建试剂盒制备链特异性cDNA文库。在Illumina HiSeq 4000平台进行150 bp双端测序，平均每样本产生4600万条reads。生物信息分析采用Trim Galore过滤低质量序列，STAR(v2.5.2b)比对至人类基因组（hg38 release 111），Rsubread统计基因表达量，DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs）（|log₂FC|≥1且adj.p<0.05）。

研究结果

数据质量与可靠性验证

原始数据经FastQC质控显示Q30>90%，人类基因组唯一比对率达94.3%（附图数据集ST1）。病毒基因组测序确认使用毒株存在PB2-I411V、NP-L456V和M-N183S突变（GenBank: PV643427.1），排除了实验室交叉污染风险。主成分分析表明生物学重复高度一致，且感染组与对照组显著分离（数据文件ST2）。

细胞类型特异性应答模式

在24小时感染期内，THP-1细胞检测到DEGs数量是A549的2.3倍（数据文件ST7），表明巨噬细胞样细胞具有更广泛的转录重编程：

• THP-1细胞：早期（4小时）即强烈上调干扰素刺激基因（ISGs）如MX1、IFIT1，同时激活TNF、IL-1β等炎症通路。Toll样受体信号（TLR3/7/8）和NOD样受体通路持续活化。
• A549细胞：延迟至8小时出现显著DEGs，主要涉及病毒RNA传感器（RIG-I/DDX58）和抗病毒效应分子（OAS1-3）。上皮细胞特有的紧密连接蛋白基因（CLDN4/7）表达显著下调，提示屏障功能受损。

时序动态变化特征

通过K均值聚类发现：

1. 早期应答模块（4-8小时）：THP-1细胞中STAT1/2调控的ISGs快速上升，而A549细胞中DNA损伤修复基因（如GADD45B）率先响应。
2. 中期转换模块（8-12小时）：THP-1细胞呈现趋化因子爆发（CXCL10/11、CCL3/4），A549细胞则激活内质网应激通路（ATF4/CHOP）。
3. 晚期调节模块（24小时）：两类细胞均出现免疫调节基因（SOCS1/3）表达，但THP-1细胞持续高表达抗原递呈相关分子（HLA-DRA/CD74），A549细胞则上调细胞周期阻滞基因（CDKN1A）。

病毒复制相关宿主因子

通过病毒基因映射分析发现：

• THP-1细胞中病毒核蛋白（NP）编码序列检出率在12小时达峰（平均覆盖率98.7%），与ISGs峰值同步
• A549细胞病毒载量持续上升至24小时，伴随内体运输基因（RAB7A/VPS29）和核糖体蛋白基因（RPL/RPS家族）的显著上调

结论与意义

本研究首次在相同实验框架下揭示：人源肺上皮细胞与巨噬细胞样细胞在H3N2流感病毒感染中展现出截然不同的分子应答策略。THP-1细胞表现为快速、强效的炎症反应，通过TLR/RIG-I双通路激活ISGs；而A549细胞呈现延迟但持续的应激反应，侧重于细胞屏障维护和病毒复制相关宿主因子的调控。这种分化应答可能解释临床中不同组织损伤模式——巨噬细胞主导的全身性炎症与上皮细胞相关的局部损伤。

研究建立的时序转录组数据集（涵盖>43×10⁶ reads/样本）填补了人类呼吸道感染模型的关键空白。其价值在于：

1. 机制研究：提供DEGs列表（数据文件ST3/ST5）支持深入挖掘免疫平衡调控靶点
2. 跨模型比较：支持与动物模型（如小鼠、雪貂）或类器官研究的数据比对
3. 生物标志物开发：THP-1细胞中发现的早期ISGs特征（如IFI44L）可作为潜在快速诊断标记物
4. 药物筛选：鉴定出RAB7A、SOCS3等细胞特异性调控节点为靶向治疗提供新思路

需要指出的是，肿瘤来源细胞系的局限性可能影响结果向原代细胞的推演。维尔茨堡大学团队已公开所有原始数据与分析流程（Figshare/ GEO），鼓励学界利用该资源推进呼吸道病毒感染精准干预策略的开发。