单细胞转录组解析Cyp26b1基因敲除对小鼠胚胎心脏发育的影响及其在左心室致密化不全中的作用机制

本研究通过单细胞RNA测序技术(scRNA-seq)系统分析了Cyp26b1基因敲除(KO)对小鼠胚胎心脏发育的调控机制。研究人员采集E10.5-E13.5时期野生型(WT)和Cyp26b1 KO小鼠心脏组织，获得134,499个高质量细胞数据，鉴定出10种主要细胞类型，发现Cyp26b1缺失导致心肌细胞(vCM/aCM)分化相关基因显著下调，特别是视黄酸(RA)信号通路异常。该研究为理解左心室致密化不全(LVNC)的发病机制提供了重要单细胞图谱资源。

　　

心脏发育是一个精密调控的生物学过程，其中心肌小梁形成和致密化是决定心室结构完整性的关键阶段。左心室致密化不全(LVNC)作为一种遗传性心肌病，其特征是胚胎期心肌致密化过程受阻，导致心室壁呈现异常的小梁结构。这种疾病可单独发生或伴随其他先天性心脏缺陷，临床表现为进行性心功能障碍、心律失常甚至猝死。尽管已知MYH7、TTN等基因突变与LVNC相关，但约42%的病例仍缺乏明确的遗传学解释，凸显了对新致病机制探索的迫切性。

近年来，视黄酸(Retinoic Acid, RA)信号通路在心脏发育中的作用日益受到关注。作为维生素A的活性代谢物，RA通过调控心肌细胞分化和心室壁重塑等过程参与心脏形态发生。Cyp26b1作为细胞色素P450家族成员，通过降解RA维持其信号平衡。临床研究发现CYP26B1基因变异与人类心血管畸形相关，动物实验也证实Cyp26b1全身敲除会导致主动脉瓣异常增厚等表型。然而，Cyp26b1在心肌致密化过程中的具体作用机制，特别是单细胞水平的转录调控网络仍属空白。

中国科学院大学联合BGI研究院的研究团队在《Scientific Data》发表了突破性研究成果。该研究通过构建Cyp26b1全身敲除小鼠模型，采用单细胞RNA测序技术对E10.5-E13.5时期的胚胎心脏进行系统分析。研究人员首先通过CRISPR/Cas9技术构建了Cyp26b1基因敲除小鼠系，PCR验证显示成功删除exon2-6区域。组织学分析发现KO小鼠在E14.5时表现出明显的心室壁致密化障碍。实验收集WT和KO组各时间点胚胎心脏组织，经过组织消化、细胞悬液制备后，使用DNBelab C系列单细胞文库制备试剂盒构建测序文库，在DNBSEQ-T7测序仪上完成测序。数据分析采用Seurat和Harmony等工具进行细胞聚类和批次校正，最终获得57,923个WT细胞和62,488个KO细胞的高质量数据集。

数据质量验证
技术验证显示所有样本的基因组比对率超过92%，外显子区域占比达85%以上，UMI中位数约20,000，每个细胞平均检测3,500个基因。通过DoubletFinder去除双细胞后，样本间相关性系数>0.96，证明数据可靠性。H&E染色证实KO小鼠存在心室壁结构异常，表现为小梁增多和致密层变薄。

细胞图谱构建
研究鉴定出10种心脏细胞类型：内皮细胞(EC)、心室肌细胞(vCM)、内皮-间质转化细胞(EndMT)、心房肌细胞(aCM)、上皮细胞(Epi)、血管平滑肌细胞(VSMC)、心外膜来源细胞(EPDC)、第二心区细胞(SHF)、红细胞(Ery)和巨噬细胞(Mac)。其中心肌细胞占比最高(28.77%)，Cyp26b1主要在WT的内皮细胞中表达。

差异表达分析
E10.5和E11.5时期差异最显著，vCM和aCM中下调基因富集于"心脏形态发生"、"间充质细胞分化"等GO条目。值得注意的是，EC和EndMT细胞中RA响应通路基因显著下调，如Rarb、Rarg等RA受体基因。心肌细胞中收缩相关基因(如Tnnt2、Myh7)和肌节组装基因表达异常，提示Cyp26b1缺失通过干扰RA信号影响心肌成熟。

功能通路解析
时序分析显示，E10.5时期KO样本的EC细胞中"RA代谢过程"相关基因显著下调，而E11.5时期vCM的"心肌收缩"通路受影响最明显。EPDC细胞中Wnt信号通路成分表达改变，暗示Cyp26b1可能通过多细胞互作调控心肌致密化。

这项研究首次在单细胞分辨率揭示了Cyp26b1缺失导致的心脏发育异常分子机制。通过构建全面的时空转录组图谱，证实Cyp26b1通过调控RA信号通路影响心肌细胞分化和心室壁重塑过程。这不仅为理解LVNC的发病机制提供了新视角，其公开的数据资源(CNP0007007)更为心脏发育研究领域提供了宝贵参考。该发现对先天性心脏病的早期诊断和靶向干预具有重要转化价值，特别是为RA信号通路相关治疗策略的开发奠定了理论基础。