多重荧光定量PCR技术同步鉴定多杀性巴氏杆菌及其A/D/F血清型的创新方法

本研究针对多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）血清型快速分型的临床需求，开发了一种四重实时荧光定量PCR（qPCR）方法，可同步检测kmt1基因（种属特异性）及hyaD-hyaC、dcbF、fcbD靶标（分别对应A/D/F血清型）。该方法灵敏度达1.7-14.52 copies/μL，变异系数<1%，在121份猫呼吸道样本中检出96份阳性（A型66例/D型1例/F型24例），为动物疫病防控和人兽共患病研究提供了高效技术工具。

　　

论文解读
在宠物数量激增的当下，一种潜伏在猫狗口腔中的细菌——多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）正成为人兽共患病的隐形威胁。这种革兰阴性菌不仅能引发猫的肺炎、人的败血症，更因A、B、D、E、F五种血清型的复杂抗原差异，使得传统血清学分型方法面临抗体制备困难、耗时长等瓶颈。尤其值得注意的是，原本主要感染禽类的F血清型近年频繁出现在家猫中，而D血清型在猫群中的零星检出更提示潜在传播风险升级。

针对这一难题，华中农业大学的研究团队在《Microbial Pathogenesis》发表突破性成果。他们创新性地将四重荧光定量PCR（qPCR）技术应用于该领域，通过设计针对kmt1种属标记基因和hyaD-hyaC（A型）、dcbF（D型）、fcbD（F型）血清型特异性片段的引物探针组合，首次实现单管反应中病原鉴定与血清分型的同步完成。研究采用标准质粒构建（pMD19-T载体）和梯度稀释验证，对121份猫呼吸道拭子进行检测，并与传统细菌分离法比对。

主要技术方法
研究团队首先从GenBank获取不同血清型菌株基因组序列（如A型HuN001/CP073238.1），克隆目标片段至标准质粒。针对临床样本，采用口腔拭子核酸提取结合四通道探针（FAM/HEX/ROX/Cy5）检测体系，通过Ct值定量分析拷贝数。关键实验包括：交叉反应性测试（含猪链球菌等近缘种）、灵敏度验证（10^-1-10⁷ copies/μL梯度）和重复性评估（批内/批间CV<1%）。

研究结果

1. 特异性验证：该方法可精准区分A/D/F血清型，与B/E型及其他呼吸道病原（如支气管败血波氏杆菌）无交叉反应。
2. 灵敏度突破：检测限达1.7 copies/μL（kmt1），血清型分型灵敏度为A型2.03 copies/μL、D型11.24 copies/μL、F型14.52 copies/μL。
3. 临床验证：96份阳性样本中，血清型分布揭示A型占68.75%（66/96），显著高于F型（25%）和D型（1.04%），与传统培养分型结果高度一致（Kappa值>0.95）。

结论与意义
该研究建立的四重qPCR技术将检测流程从传统方法的3-5天缩短至2小时，其高通量特性（单次运行96样本）特别适合大规模流行病学调查。发现家猫中F血清型的较高流行率（24/96）警示其可能成为新型人兽共患病传播源。方法学创新为动物疫病防控提供"快准狠"的技术武器：一方面助力宠物诊所快速制定精准治疗方案，另一方面为公共卫生部门监测血清型变迁提供分子工具箱。正如通讯作者Zhong Peng团队强调，该技术未来可扩展至其他宿主（如禽类/猪）的血清型监测网络构建，对解析细菌跨种传播机制具有重要科学价值。