TLR2激活通过调控钙信号和自噬提升牛早期胚胎体外发育能力

本研究针对体外生产(IVP)牛胚胎发育能力不足的问题，通过激活Toll样受体2(TLR2)信号通路，发现其能显著提高囊胚形成率并加速发育进程。研究人员证实TLR2激动剂处理可上调胚胎胞质Ca2+水平、诱导自噬(autophagy)，同时抑制组织蛋白酶B(cathepsin B)活性和DNA损伤，最终降低细胞凋亡率。该研究为优化辅助生殖技术(ART)提供了新策略，发表于《Scientific Reports》。

　　

在畜牧业和辅助生殖领域，如何提高体外生产(IVP)胚胎的质量一直是重大挑战。与体内发育的胚胎相比，IVP胚胎存在发育迟缓、囊胚形成率低等问题，这严重限制了胚胎移植技术的应用效率。近年来，先天免疫受体Toll样受体(TLRs)家族在生殖系统中的功能逐渐受到关注，但它们在早期胚胎发育中的具体作用仍属未知。

日本北海道带广畜产大学(Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine)的Dongxue Ma等研究人员在《Scientific Reports》发表的研究，首次揭示了TLR2在牛早期胚胎中的表达模式及其调控发育的分子机制。研究团队通过系统的体外实验证明，在受精后36小时(hpi)用100 ng/ml TLR2激动剂处理胚胎，可使其囊胚形成率提高1.5倍，并加速发育进程约6-12小时。

研究采用的主要技术包括：时间推移成像系统追踪胚胎发育动态；免疫荧光和Western blot检测TLR2表达谱；Fluo-4 AM钙离子成像分析；Cyto-ID自噬检测试剂盒评估自噬活性；γ-H2A.X染色检测DNA损伤；以及TUNEL法量化细胞凋亡。所有实验均使用屠宰场采集的牛卵巢分离的卵母细胞，经体外成熟(IVM)和体外受精(IVF)获得胚胎。

TLR2在早期牛胚胎中的表达
免疫荧光显示TLR2蛋白在卵母细胞、MII期卵母细胞及各阶段胚胎(4细胞、8细胞、桑椹胚和囊胚)中持续表达，主要定位于质膜和细胞质。Western blot检测到约95 kDa的特异性条带，与预测分子量相符。

TLR2激活促进胚胎发育
时间推移成像显示，TLR2激动剂处理组胚胎在138-162 hpi期间囊胚形成率显著高于对照组。Day 7时，处理组囊胚总数增加，且扩张囊胚(ExB)比例明显升高。RT-PCR分析发现处理组囊胚中干扰素-tau(IFNT)表达上调，而凋亡相关基因caspase-3表达下降。

钙信号与自噬调控机制
尽管TLR2激活未引起急性钙响应，但Day 7囊胚胞质Ca²⁺基础水平轻微升高。自噬活性检测显示处理组囊胚自噬小体数量显著增加，同时组织蛋白酶B活性和γ-H2A.X阳性细胞比例降低，提示DNA损伤减少。

凋亡水平变化
TUNEL实验证实TLR2激活使囊胚凋亡细胞减少30%，死亡细胞指数(DCI)下降。差异染色显示内细胞团(ICM)与滋养层(TE)细胞比例保持稳定。

这项研究首次阐明TLR2通过"钙信号-自噬-凋亡"轴调控胚胎发育的新机制：TLR2激活引发微弱先天免疫反应（短暂上调TNFA），持续刺激使胞质Ca²⁺水平轻微升高，进而激活自噬系统清除受损细胞器；同时通过抑制组织蛋白酶B活性和DNA损伤来减少凋亡。该发现不仅为理解胚胎先天免疫系统功能提供新视角，更为优化IVP培养体系提供了可操作性方案——通过精确调控TLR2激活程度，可在不引起过度炎症反应的前提下提升胚胎质量。

研究团队特别指出，100 ng/ml的TLR2激动剂浓度呈现"Goldilocks效应"（最适效应）——低于此浓度效果不显著，而过高浓度(1000 ng/ml)反而抑制发育。这种剂量依赖性提示TLR2信号需要精确调控才能发挥生理性作用。未来研究需进一步验证该方案在胚胎移植中的实际应用价值，并探索TLR2下游效应分子的具体作用机制。