基于TaqMan探针的多重实时RT-qPCR同步检测鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒及鸭甲肝病毒1/3型的建立与应用

针对鸭坦布苏病毒（DTMUV）、新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）、鸭甲肝病毒1型（DHAV-1）和3型（DHAV-3）混合感染诊断难题，本研究开发了一种高效的四重TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测体系。该方法灵敏度达101-102拷贝/μL，特异性强（无DEV/MDPV等交叉反应），批间变异系数<10%。临床验证215份样本显示DHAV-3阳性率最高（16.27%），并首次揭示DTMUV/DHAV-3共感染率达5.58%，为水禽病毒流行病学监测提供了关键技术支撑。

　　

鸭养殖业面临多种病毒混合感染的严峻挑战，鸭坦布苏病毒（DTMUV）、新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）、鸭甲肝病毒1型（DHAV-1）和3型（DHAV-3）的流行常导致神经症状、产蛋下降甚至死亡。这些病毒临床症状相似，且常与其他病原（如禽流感病毒）共感染，传统单一检测方法效率低下，难以满足现场快速诊断需求。针对这一痛点，国内研究人员在《Poultry Science》发表突破性研究，首次建立可同步检测四种核心鸭病原的多重实时荧光定量RT-PCR技术，为水禽业疫病防控提供了"一管四检"的高效工具。

研究团队采用多重探针设计结合正交实验优化技术体系。首先基于病毒保守基因（DTMUV的E基因、NDRV的Sigma C基因、DHAV-1/3的VP1基因）设计特异性引物与荧光探针，通过温度梯度（52-57°C）和浓度矩阵测试（2-8 μM）确定最佳反应条件。临床验证采用215份中国多省份鸭组织样本，通过高灵敏核酸提取与标准质粒构建建立定量标准曲线。关键技术包括：探针多重标记（FAM/HEX/ROX/CY5）、单管四通道扩增、变异系数（CV）评估体系等。

研究结果

优化反应体系
通过正交实验确定最佳退火温度52°C，引物/探针浓度组合为：

• DTMUV：引物4 μM/探针6 μM
• NDRV：引物6 μM/探针8 μM
• DHAV-1：引物2 μM/探针4 μM
• DHAV-3：引物6 μM/探针8 μM
  （表2、3）

灵敏度验证
单重检测限：

• DTMUV：8.08×10¹ 拷贝/μL
• NDRV：1.24×10² 拷贝/μL
• DHAV-1：6.03×10¹ 拷贝/μL
• DHAV-3：1.88×10² 拷贝/μL
  多重检测灵敏度与单重相当，扩增效率82-97%，R²>0.99（图2、3）

特异性验证
与鸭瘟病毒（DEV）、番鸭细小病毒（MDPV）、鹅细小病毒（GPV）、新城疫病毒（NDV）和禽流感病毒（AIV）无交叉反应（图4）

重复性验证
批内/批间变异系数（CV）均<10%：

• DTMUV：批内CV 1.7-4.8%
• NDRV：批间CV 1.3-4.3%
• DHAV-1：批内CV 1.9-7.1%
• DHAV-3：批间CV 0.8-1.6%
  （表4）

临床样本检测
215份样本阳性率：

• DHAV-3：16.27%（35/215）
• DTMUV：9.30%（20/215）
• DHAV-1：5.58%（12/215）
• NDRV：2.32%（5/215）
  共感染模式中，DHAV-3/DTMUV双感率达5.58%，三病毒共感（DHAV-3/DTMUV/NDRV）占0.05%（表5）。地域分析显示福建（DTMUV 15例）、山东（DHAV-3 15例）为高发区（表6）。

结论与意义

本研究建立的TaqMan探针多重RT-qPCR技术首次实现四种鸭主要病原的单管同步检测。其核心优势在于：

1. 高效性：较传统PCR灵敏度提升10-100倍，检测限达10¹拷贝级
2. 精准性：正交优化体系保障多靶标扩增效率（>82%），CV<10%满足临床标准
3. 流行病学价值：首次揭示DHAV-3为中国当前优势流行株（16.27%），并量化共感染比例

该技术突破混合感染诊断瓶颈，为鸭群疫病早期预警、疫苗评估及净化计划提供关键技术工具。未来需扩大样本量验证跨毒株适用性，并探索与便携式qPCR设备的整合以实现现场快速诊断。

（注：研究机构归属依据基金项目"江西省双千计划（jxsq2023201121）"及试剂供应商"Sangon Biotechnology（上海）"等信息判定为国内研究，通讯机构未明确标注）