超声成像技术实现实体瘤中巨噬细胞(MΦ)单细胞水平动态追踪

本研究针对实体瘤微环境(TME)中巨噬细胞(MΦ)示踪技术灵敏度不足的难题，开发了基于脂质微泡(MB)标记的超声(US)成像新方法。研究人员通过FDA批准的Definity微泡标记巨噬细胞，证实低机械指数(MI<0.34)超声可无损监测MΦ迁移、表型及细胞因子分泌，在啮齿类动物模型中实现静脉注射后8小时内MΦ积聚和外渗的非线性超声成像。该技术为癌症免疫治疗监测提供了便携式高分辨率平台。

　　

在癌症研究领域，巨噬细胞(MΦ)作为肿瘤微环境(TME)的关键调控者，其动态行为与癌症进展、治疗响应密切相关。然而现有成像技术面临两难困境：光学方法受限于穿透深度，MRI/PET虽能全身成像但分辨率不足，且检测限高达10³-10⁵个细胞/毫升。更棘手的是，巨噬细胞与肿瘤组织声阻抗相近(σ_macrophage≈σ_cancer)，传统超声无法区分。这种技术瓶颈严重阻碍了CAR-MΦ疗法等新型免疫治疗的临床转化。

针对这一挑战，来自Georgia Institute of Technology（美国佐治亚理工学院）的Costas Arvanitis团队在《Nature Communications》发表突破性研究。他们创新性地将FDA批准的超声造影剂Definity微泡(MB)通过巨噬细胞固有吞噬作用实现标记，开发出兼具单细胞灵敏度与毫米级穿透深度的超声成像平台。该技术不仅首次实现活体MΦ迁徙的实时动态监测，更令人振奋的是，低机械指数(MI=0.14)的超声脉冲既能激发MB非线性振荡产生谐波信号，又可保持细胞活力>95%，完美解决了成像破坏性的传统难题。

研究团队运用四大关键技术：

1. 微泡标记优化：利用巨噬细胞吞噬特性，通过培养皿倒置法提升MB-MΦ标记效率(RAW264.7细胞达75.7%±9.3%)
2. 双模态超声成像：采用B型超声(B-Mode)和调幅脉冲反转(AMPI)非线性序列，在15.625MHz频率下实现轴向98.5μm分辨率
3. 跨物种验证：涵盖小鼠RAW264.7细胞、原代骨髓源性巨噬细胞(BMDM)及人源巨噬细胞/树突状细胞(DC)
4. 多尺度分析：结合流式细胞术(检测限12%肿瘤浸润MΦ)、活体超声定位显微镜(血管成像)和免疫荧光(外渗验证)

【巨噬细胞可被微泡稳健标记且保持迁移能力和表型】
通过高内涵成像证实，M1极化MΦ的MB吞噬量显著增加，但MB标记不影响CD86/iNOS(M1)和CD206/Arg1(M2)标志物表达(p>0.05)。Transwell实验显示，MB-MΦ在4T1癌细胞趋化下的迁移效率与未标记组无差异(p=0.9137)，ELISA检测IL-6/TNF-α等细胞因子分泌谱亦无变化。

【被吞噬的微泡保持声学活性且不影响细胞活力】
高速光学显微(500万帧/秒)揭示：胞内MB呈现压缩单向振荡(压缩率-19%±3.5% vs 自由MB-30%±5.2%)。在MI=0.08-0.34区间，MB-MΦ产生强谐波信号但死亡率仅3.3%±2.5%，而MI>0.51时宽带发射导致死亡率骤增至23.8%±6.2%(p<0.0001)。

【低机械指数超声可体外检测单个微泡标记巨噬细胞】
在3.2μL仿体模型中，AMPI序列在MI=0.14时信噪比达9.9±1.2dB，可稳定追踪1000帧(约33秒)。衍射极限测试显示，该系统横向分辨率达116μm，成功识别流动体系中的单细胞信号。

【超声成像可监测实体瘤中微泡标记巨噬细胞的运输】
静脉注射2×10⁶ MB-MΦ后，非线性超声信号在4T1肿瘤外周持续增强8小时。流式分析证实12%的肿瘤浸润白细胞为MB-MΦ，其中65%保持活力。值得注意的是，CD206⁺ M2样表型在肿瘤微环境中显著增加，与临床预后标志物趋势一致。

这项研究开创性地将超声成像灵敏度推进至单细胞水平，其检测限(10个MB-MΦ)比现有临床模态提升两个数量级。相较于破坏性的纳米液滴超声相变法，MB标记策略实现了长达8小时的无损监测窗口，为CAR-MΦ疗法等细胞治疗提供了实时质控工具。技术突破背后是三个关键发现：首先，巨噬细胞溶酶体对MB的包裹形成天然声学谐振腔，即使阻尼环境下仍能产生非线性信号；其次，M1极化状态可增强MB吞噬量，暗示表型可调的标记策略；最后，临床级Definity微泡与多种免疫细胞兼容，包括人源DC中CD83⁺成熟度提升(p<0.05)。这些发现不仅重新定义了超声在细胞示踪领域的地位，更通过便携式设备解决了肿瘤免疫研究中的时空分辨率矛盾，为个性化免疫治疗响应评估开辟了新途径。