RNF114作为ADPr-Ub阅读器的鉴定及其在DNA损伤应答中的功能机制研究

本研究通过合成非水解型泛素化ADP-核糖（ADPr-Ub）探针，结合定量蛋白质组学技术，首次鉴定出E3泛素连接酶RNF114作为ADPr-Ub的特异性阅读器。研究人员发现RNF114通过其串联锌指结构域（ZnF2+ZnF3）和泛素相互作用模体（UIM）协同识别ADPr-Ub，并催化形成K11连接的多聚泛素链。该成果揭示了ADP-核糖化与泛素化交叉调控的新机制，为DNA损伤应答等病理过程提供了新的分子靶点。

　　

在生命活动的精密调控网络中，蛋白质翻译后修饰如同交响乐中的音符，通过复杂组合传递着细胞信号。其中泛素化（Ubiquitination）和ADP-核糖化（ADP-ribosylation）作为两种关键修饰方式，近年来被发现存在令人着迷的交叉对话。当这两种修饰在DNA损伤应答和免疫反应中相遇时，会形成一种独特的"混合信号"——泛素化的ADP-核糖（ADPr-Ub）。然而，这种特殊修饰的生物学功能一直如同蒙着面纱，其识别机制和下游效应更是未解之谜。

来自荷兰莱顿大学医学中心（Leiden University Medical Center）的研究团队决心揭开这一谜题。他们面临的挑战显而易见：ADPr-Ub中的酯键极易水解，传统方法难以捕捉其瞬时相互作用。就像试图用漏勺捞起水中的月亮，研究人员需要开发全新的工具来"定格"这种不稳定的修饰。这项突破性研究最终发表在《Nature Communications》上，为理解翻译后修饰的交叉调控开辟了新视角。

研究团队采用了多学科交叉的技术路线：首先通过固相肽合成和点击化学构建了非水解型ADPr-Ub探针1；运用定量蛋白质组学技术筛选互作蛋白；结合生物层干涉仪（BLI）和表面等离子共振（SPR）验证结合亲和力；通过体外泛素化实验分析酶活特性；最后采用激光显微切割技术观察蛋白在DNA损伤位点的募集。

合成ADPr-Ub类似物
研究人员巧妙设计了三唑连接的ADPr-Ub探针1，通过将3'-O-炔丙基化ADPr与C端叠氮化物修饰的泛素进行铜催化叠氮-炔环加成反应（CuAAC），成功获得稳定性显著提高的模拟物。这种化学合成策略避免了天然酯键的酸/碱敏感性，为后续研究提供了关键工具。

鉴定ADPr-Ub阅读器

定量蛋白质组学分析显示，RNF114及其旁系同源物RNF138、RNF166是ADPr-Ub探针1的最显著结合蛋白。生物物理实验证实RNF114对ADPr-Ub的结合亲和力（K_D=0.28μM）比单独泛素或ADPr高两个数量级，这种特异性识别暗示其在ADPr-Ub信号解码中的核心作用。

RNF114延伸ADPr-Ub
研究发现RNF114能独特地催化ADPr-Ub延伸形成K11连接的多聚泛素链，而其他测试的E3连接酶（如Nedd4、TRIM25等）均未显示此活性。中子编码泛素实验证实RNF114偏好形成K11连接（占92%），这与K11特异性去泛素化酶Cezanne的切割实验结果相互印证。

结构域功能解析

通过构建系列截短体和突变体，研究揭示ZnF2+ZnF3+UIM结构域是RNF114识别ADPr-Ub的最小功能模块。其中UIM结构域突变（V220G/L221G/S224G）使结合亲和力降低25倍，而ZnF3结构域的Y186A突变（预测破坏ADPr结合）则导致3倍减弱。特别值得注意的是，连接ZnF3与UIM的接头区域对维持延伸活性至关重要，其甘氨酸/丝氨酸替换会完全破坏ADPr-Ub延伸能力。

DNA损伤位点募集

激光显微照射实验显示，野生型RNF114能快速募集至DNA损伤位点，而UIM缺失或ZnF3/Y186A突变体则丧失此能力。这一发现将ADPr-Ub识别与DNA损伤应答直接关联，表明RNF114可能通过解码ADPr-Ub信号参与基因组稳定性维护。

这项研究首次系统阐明了ADPr-Ub修饰的识别与延伸机制，揭示了翻译后修饰交叉调控的新范式。其重要意义体现在三个维度：在基础研究层面，发现ZnF2+ZnF3+UIM结构域构成新型双修饰阅读器模块，为理解"泛素密码"的扩展提供了分子基础；在技术层面，开发的非水解型ADPr-Ub探针为研究不稳定的酯键连接修饰树立了方法学典范；在医学应用层面，RNF114介导的ADPr-Ub信号通路可能成为癌症（特别是BRCA突变肿瘤）治疗的新靶点，天然产物nimbolide对该通路的抑制作用已显示出抗肿瘤潜力。

这项研究也留下了值得探索的新问题：除RNF114外，其旁系同源物RNF138/RNF166是否具有相似功能？ADPr-Ub修饰