双色MINFLUX纳米追踪技术揭示烟碱型乙酰胆碱受体与胆固醇的协同扩散动力学

研究人员利用MINFLUX超分辨显微镜技术，开发了一种新型双色单分子共追踪方法，成功实现了活细胞膜上烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)与荧光胆固醇(fPEG-Chol)的同步观测。该研究突破传统显微技术的时空分辨率限制，首次在亚毫秒时间尺度(492±780μs)和纳米级精度(σ=7±1nm)下，揭示了胆固醇依赖的nAChR异质性扩散行为及两者的空间共定位现象(C=0.27±0.02)，为理解膜蛋白-脂质相互作用提供了全新视角。

　　

细胞膜上蛋白质与脂质的动态相互作用是生命活动的核心过程，但传统显微技术受限于时空分辨率，难以捕捉这些转瞬即逝的分子事件。烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)作为重要的神经递质受体，其功能受膜胆固醇水平显著调控，然而两者在纳米尺度的协同运动机制始终成谜。德国耶拿莱布尼茨光子技术研究所(Leibniz Institute of Photonic Technology, Germany)的研究团队通过创新性整合MINFLUX超分辨显微技术与双色比率检测方案，首次实现了nAChR与胆固醇在活细胞膜上的同步追踪，相关成果发表于《Nature Communications》。

研究采用MINFLUX显微镜的连续激发模式，通过640nm单波长同步激发CF?680R标记的α-银环蛇毒素(CF?680R-BTX)和Abberior STAR Red标记的聚乙二醇胆固醇(fPEG-Chol)，利用发射光谱比率差异实现双色分辨。对CHO-K1/A5细胞系进行标记后，以10kHz采样率获取单分子轨迹，结合深度学习CONDOR算法分析扩散模式。

MINFLUX双色共追踪技术开发
研究人员建立探测器通道比率(DCR)标准，通过701nm/655nm发射光强度比区分nAChR与胆固醇信号。该方法在保持7nm定位精度的同时，实现492μs时间分辨率，较传统STORM技术提升100倍光子利用率。

胆固醇依赖的扩散异质性
时间平均均方位移(TA-MSD)分析显示，nAChR呈现三种扩散模式：亚扩散(β<0.9)、布朗运动(0.9≤β≤1.1)和超扩散(β>1.1)。胆固醇存在时，nAChR的广义扩散系数K_β从0.428增至0.926μm²s^-β，而胆固醇探针自身扩散速度提升1.4倍。

动态状态定量解析
轨迹分段分析揭示：nAChR在限制态平均停留66±8ms，自由态12±1ms；添加胆固醇后，状态转换速率从25.49s^-1提升至48.27s^-1。转角分析显示限制区内90-180°反相关步进占优，证实空间阻碍效应。

空间共定位证据
创新性定义重叠系数C量化共定位程度，发现27%的nAChR限制区与胆固醇轨迹重叠，非限制区重叠达40%。添加100nM未标记胆固醇使C值降低2/3，证实特异性相互作用。

细胞骨架调控作用
Arp2/3抑制剂CK-666处理使肌动蛋白区室尺寸从163nm增至252nm，nAChR的短程扩散系数D_μ从42,181增至54,158nm²s^-1，揭示细胞骨架对分子运动的双重限制机制。

该研究通过MINFLUX技术突破性实现膜蛋白-脂质相互作用的纳米级动态观测，建立"双态阻碍扩散"模型解释nAChR运动特性。发现胆固醇不仅改变受体扩散速率，更通过形成瞬时共扩散区域(平均尺寸0.006-0.008μm²)直接参与膜微区组织。这种协同运动可能影响nAChR的聚集状态和信号转导效率，为神经突触可塑性和胆固醇相关神经系统疾病研究提供新思路。技术层面开发的单波长双色比率检测方案，为多分子互作研究树立了新范式。