人肠道类器官-巨噬细胞共培养模型中巨噬细胞对诺如病毒感染细胞的吞噬作用及其免疫调控机制

本研究利用人肠道类器官(HIEs)与巨噬细胞共培养模型，首次揭示巨噬细胞亚型（M0/M1/M2）在人类诺如病毒(HuNoV)感染中的动态响应：M1型巨噬细胞表现出最强的吞噬活性，而病毒复制不受巨噬细胞影响。研究发现感染后顶端分泌的IP-10、MIP-1α等趋化因子及IL-6等炎症介质显著升高，揭示了上皮-巨噬细胞互作在启动早期抗病毒应答中的关键作用，为肠道黏膜免疫研究提供了新范式。

　　

ABSTRACT

人类诺如病毒(HuNoV)是导致各年龄段急性胃肠炎的重要病原体，在免疫缺陷个体中可引发慢性感染。研究采用创新的离体人肠道类器官(HIEs)-巨噬细胞共培养模型，模拟体内肠道微环境，系统评估了不同巨噬细胞亚型（未极化M0、促炎M1、抗炎M2）在HuNoV感染中的作用。结果显示，极化于Transwell的HIEs感染后病毒基因组呈双侧释放（以顶端为主），而巨噬细胞的加入不改变病毒复制水平。关键发现是巨噬细胞通过吞噬病毒感染的肠上皮细胞参与免疫清除，其中M1型巨噬细胞吞噬活性最强。感染后顶端区室中IP-10、MIP-1α、RANTES等趋化因子及IL-1α、IL-6等炎症介质显著升高，凸显了上皮-巨噬细胞互作在招募白细胞和启动宿主应答中的核心地位。

INTRODUCTION

HuNoV属于杯状病毒科，通过粪-口途径传播，全球每年造成重大疾病负担。尽管免疫健全者感染多为自限性，但移植患者等免疫缺陷人群可出现慢性化。既往研究多采用缺乏免疫细胞的HIEs模型，而本研究通过整合外周血单核细胞来源的巨噬细胞，首次构建了更接近生理状态的共培养体系。肠道活检证据显示，慢性HuNoV感染患者的CD68⁺巨噬细胞可吞噬VP1⁺/CK8⁺上皮细胞，这为探索巨噬细胞的抗病毒机制提供了临床依据。

RESULTS

屏障功能与病毒复制动态
通过流式细胞术验证巨噬细胞亚型标志物：M1高表达CD80（P < 0.0001），M2高表达CD206（P < 0.01）。共培养24小时后，HIE单层上皮高度和跨上皮电阻(TEER)均未受巨噬细胞影响。感染实验显示，HuNoV GII.4[P31]在HIEs中复制24小时后，顶端病毒载量提升2 log₁₀，基底侧提升1.6 log₁₀，且巨噬细胞亚型均不改变此趋势。

吞噬作用的亚型特异性
免疫荧光显示，M1巨噬细胞对VP1⁺/CK8⁺细胞的吞噬率（1.9% ± 1.0%）显著高于M0（0.1% ± 0.1%，P < 0.05）。正交视图证实CD68⁺细胞仅定位于单层顶端，提示巨噬细胞需迁移至感染灶执行清除功能。

细胞因子风暴的特征
基线状态下，M1共培养诱导Th1型反应（IP-10、IFN-γ、IL12p40显著升高），而M2促进IL-10等抗炎因子分泌。感染后，M1/M2共培养组顶端IP-10、RANTES及IL-6水平显著增加（>2倍），且Spearman分析显示吞噬指数与顶端IL-10（r > 0.75）、TGF-α呈正相关，与基底侧MIP-1β负相关。

DISCUSSION

本研究突破性地揭示：1）HuNoV复制严格依赖肠上皮细胞，与巨噬细胞亚群无关；2）M1巨噬细胞通过"上皮巡逻"机制高效清除感染细胞；3）IP-10作为早期预警信号，可能驱动后续免疫细胞募集。这些发现为靶向巨噬细胞极化状态的免疫干预策略提供了理论依据，如利用M1型增强病毒清除或调控M2型减轻炎症损伤。

MATERIALS AND METHODS

技术亮点包括：1）采用胶原IV包被Transwell构建极化HIEs；2）通过M-CSF联合LPS/IFN-γ或IL-4诱导巨噬细胞亚型；3）γ-灭活病毒对照排除粪便成分干扰；4）Luminex多因子检测揭示时空动态分泌谱。该模型亦可拓展至沙门氏菌等肠道病原体研究，具有广泛的应用前景。