发现新型药效团和潜在候选化合物，用于研发针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的抗病毒药物

《Bioorganic Chemistry》：Unveiling novel pharmacophores and hit compounds for the development of anti-virals to treat severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)

本研究通过靶向SARS-CoV-2主要蛋白酶（MPro）和蛋白酶（PLPro）及表型筛选，从内部化学库的33种化合物中鉴定出3种新型抗病毒活性物质（氯喹类似物及硼杂环化合物），其中45%的化合物显示低微摩尔级MPro抑制活性。

　　

摘要

呼吸系统感染COVID-19是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的，该病毒持续在全球范围内传播，每年导致超过一百万人死亡。尽管已经迅速开发出用于预防的疫苗，但仍迫切需要治疗性药物来对抗这种已建立的感染。基于这一目标，我们对内部化学库中的一部分化合物进行了针对SARS-CoV-2蛋白酶（M^Pro）的靶点筛选和表型筛选。所选化合物之前已在不同的疾病模型中进行了研究。大约45%的化合物在低μM浓度范围内显示出对M^Pro的抑制活性。此外，在测试的26种化合物中，有3种（11%）对SARS-CoV-2表现出真正的抗病毒活性（SI > 2）。其中一种属于氯喹杂环化学类型，之前已有报道其具有抗SARS-CoV-2活性。其余两种新型化合物属于多面体硼体系、金属碳硼烷和二碳闭十二硼烷化学类型，这些类型之前尚未被报道具有抗病毒活性。除了针对M^Pro外，氯喹衍生物和金属碳硼烷衍生物也抑制了SARS-CoV-2的木瓜蛋白酶。

引言

自2019年以来，严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）已成为全球健康问题，截至2025年6月已导致超过7.78亿例确诊病例和700多万例死亡[1]。相关疾病COVID-19会影响胃肠道、肾脏和中枢神经系统的生理功能，并引发多种严重并发症，如肺纤维化、呼吸衰竭、肺栓塞、免疫反应改变和细胞代谢异常[2]。幸运的是，科学界迅速应对了COVID-19大流行，实施了多项公共卫生策略。姑息性化疗和疫苗接种在控制病毒传播和疾病进展方面发挥了重要作用[3][4][5]。随后，首个针对SARS-CoV-2的联合药物的研发有助于减轻疾病负担，尤其是在高风险群体中[6]。然而，该病毒的显著突变能力以及自然接种和人工接种个体中无法产生长期免疫保护（抗体水平下降）的事实表明，SARS-CoV-2无法被完全根除，仍将是全球性的威胁。在这种情况下，针对这种感染的药物发现研究对于提供可行的备选药物至关重要。病毒蛋白酶被认为是治疗开发的有希望的目标，因为它们在病毒复制、成熟、组装和细胞进入过程中起着重要作用[7]。SARS-CoV-2基因组编码两种蛋白酶——类胰凝乳蛋白酶的M^Pro和木瓜蛋白酶的PL^Pro，这两种蛋白酶早期就被视为药物靶点。这种兴趣源于它们在将长病毒多肽分解为单独的结构蛋白和非结构蛋白中的关键作用[8]。M^Pro和PL^Pro是半胱氨酸蛋白酶，对肽底物的水解具有序列和机制特异性。病毒多肽在11个位置被M^Pro切割，在3个不同位置被PL^Pro切割。此外，PL^Pro还对宿主的泛素和干扰素刺激基因15（ISG-15）具有肽酶活性，后者是病毒复制和宿主免疫反应的关键调节因子[9]。遗传学和化学研究证实了M^Pro对SARS-CoV-2复制的重要性，从那时起，寻找针对这种病毒酶的潜在药物的研究得到了加强[10]。

为了发现新的抗病毒化合物，我们报告了针对我们内部化学库中不同化学类型的代表性化合物（衍生物(1)–(33)）进行的靶点（M^Pro）和表型（SARS-CoV-2）筛选结果，见图1和表1、表2、表3、表4、表5。化合物的选择基于以下标准：i) 对M^Pro和SARS-CoV-2有效的化合物(A)-(D)和(I)[11,12]；ii) 对其他病毒或其靶点有效的化合物(E)–(H)[13][14][15]。

部分内容

化学物质

所选化合物来自我们的内部化学库（衍生物(1)–(33)，见图1和表1、表2、表3、表4、表5[16][17][18][19][20][21][22][23][24][25][26][27][28][29][30][31][32][33]。

SARS-CoV-2 M^Pro和PL^Pro的表达与纯化

SARS-CoV-2 M^Pro和PL^Pro的重组形式按照先前的方法进行表达和纯化[34]。

M^Pro活性测定

M^Pro活性是通过蛋白酶作用后Edans荧光（5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸）的退激发来确定的

化合物选择的背景信息和理由

首先，我们探索了一系列双(芳基酰基)酮的潜力，这些化合物是化合物(A)（图1）的生物异构体或简化结构（我们之前发现的一种双(噻吩基)环酮[11]），它显示出中等的M^Pro抑制活性，无细胞毒性，但缺乏抗SARS-CoV-2活性；以及化合物(E)（Srour及其合作者描述的一种双(噻吩基)哌啶酮[13]（图1），据报道它具有选择性的抗SARS-CoV-2活性。

结论

我们的研究证实，双(芳基酰基)酮作为M^Pro的抑制剂效果较弱，并且对SARS-CoV-2感染的细胞具有细胞毒性。这是未来优化这一骨架结构时需要解决的问题。对于含有N-环结构的骨架，4-氨基喹啉类化合物产生了更多的M^Pro抑制剂（六种化合物中有四种有效，Chq、(12)、(15)和(16)，IC₅₀约为25至2.5 μM），而基于邻苯二甲嗪的化合物中只有一种有效（(8)，IC₅₀为22 μM）。

CRediT作者贡献声明

Belén Dávila：研究、数据分析。Martín Fló：撰写——初稿、方法学、研究。Santiago Ruatta：撰写——审阅与编辑、研究。Franca Lorenzelli：撰写——审阅与编辑、研究。Andrea Medeiros：撰写——审阅与编辑、研究。Jonathan Bastidas：撰写——审阅与编辑、研究。Gonzalo Rodríguez：撰写——审阅与编辑、研究。Elena Aguilera：撰写——审阅与编辑、研究。María Fernanda García：

资助

我们衷心感谢CSIC-Universidad de la República（专门知识以应对COVID-19及其影响，项目编号15）、巴斯德研究所的COVID-19紧急筹款活动、国际遗传工程与生物技术中心（CRP/URY20–03）以及FOCEM（南共市结构融合基金，项目编号COF 03/11）提供的财政支持。此外，还得到了国家研究机构的额外支持

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢Hilgenfeld R.（德国吕贝克大学德国感染研究中心）和?iki? I.（德国法兰克福马克斯普朗克生物物理研究所）分别提供了M^Pro和PL^Pro的表达载体。