载体介导转运：抗生素进入细菌的普遍途径及其对抗菌药物设计的启示

这篇综述颠覆了传统认知，揭示载体介导转运（CM）是抗生素穿越细菌细胞膜的主要途径，而非被动脂质扩散（PLD）。通过基因敲除和竞争生长实验，研究团队在金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）中鉴定出多种抗生素转运蛋白（如NCS-2家族渗透酶），证明临床常用抗生素（如环丙沙星CIP、甲氧苄啶TMP）通过模拟天然代谢物结构"搭便车"进入细菌。该发现为破解抗菌药物发现困境提供了新思路——通过设计代谢物类似物，利用细菌固有转运系统实现药物递送。

　　

ABSTRACT
抗菌药物发现面临的核心挑战是如何使小分子抑制剂穿透细菌细胞膜到达靶点。传统观点认为抗生素主要通过细胞质膜（CM）的脂质双层被动扩散（PLD），但缺乏实验证据支持。本研究通过失活单个或多个CM转运蛋白后的抗生素积累测定，证明多种经典抗生素类别（如氟喹诺酮类、四环素类）实际依赖载体蛋白穿越CM。某些抗生素与转运蛋白天然底物的化学相似性揭示了药物转运的分子逻辑，表明载体介导的摄取是抗生素进入细菌的普遍途径。

IMPORTANCE
病原菌耐药性加剧迫使人类急需新型抗菌药物。本研究证实细菌膜转运蛋白介导的摄取是抗生素进入细胞的常见途径，为抗菌药物设计指明方向：通过模拟转运蛋白天然底物结构，实现抑制剂载体介导的胞内递送。

INTRODUCTION
细菌耐药性正使现有抗菌武器库逐渐失效。过去35年抗菌药物研发陷入"发现真空期"，关键瓶颈在于缺乏对小分子穿透细菌膜机制的认知。虽然革兰阴性菌外膜（OM）穿透规则已有进展，但对所有病原菌共有的CM穿透机制仍知之甚少。

传统认为临床抗生素主要通过PLD穿过CM，仅少数例外（如D-环丝氨酸和磷霉素FOS通过载体蛋白转运）。本研究提出假说：载体介导转运才是抗生素穿越CM的主要方式。支持证据包括：多数抗生素缺乏适合脂质扩散的cLogP值；PLD缺乏实验验证；自然界中小分子普遍依赖载体跨膜转运。

MATERIALS AND METHODS
采用金黄色葡萄球菌转运蛋白基因敲除库（SATKO库）进行筛选，包含318个NTML库中的转运蛋白突变株。通过竞争生长实验（混合培养荧光检测法）和LC-MS抗生素积累测定，鉴定抗生素转运蛋白。在大肠杆菌Keio敲除库中验证发现。

关键实验方法：

1. 抗生素敏感性测试：微量肉汤稀释法测定MIC
2. 竞争生长实验：荧光标记亲本株与突变株共培养，检测亚MIC浓度下的竞争优势
3. 积累测定：CIP通过荧光检测，其他抗生素用LC-MS定量
4. 等位基因交换：使用pIMAY-Z载体进行无痕基因删除

RESULTS
NCS-2家族渗透酶作为金黄色葡萄球菌中CIP转运蛋白
筛选发现两个CIP抗性突变株（NE280和NE283），分别失活NCS-2家族渗透酶SAUSA300_0387和SAUSA300_2207。基因敲除株显示CIP MIC升高（6-10 μg/mL vs 亲本5 μg/mL），胞内CIP积累减少10-30%。结构分析显示CIP与天然底物黄嘌呤存在共同核心环（Tanimoto评分0.55）。

竞争生长实验鉴定多类抗生素转运蛋白
验证实验显示：

• 磷霉素FOS转运蛋白glpT突变株在1/64 MIC即显现竞争优势
• CIP转运蛋白突变株在接近MIC浓度显现竞争优势

筛选发现四类抗生素的多种转运蛋白：

1. CIP：NCS-2家族、麦芽糖转运蛋白等6个
2. TMP：聚胺、硫胺等17个（其中SAUSA300_0979敲除使MIC升高6.7倍）
3. 夫西地酸FUS：乳酸、柠檬酸等9个
4. 莫匹罗星MUP：丙氨酸、钾离子等6个

多重转运蛋白失活进一步抑制抗生素摄取
构建四重敲除株发现：

• CIP：ΔNCS-2/0978/2379使MIC升至16 μg/mL，积累降至65%
• MUP：四重敲除株积累降至45%（单敲除为82-90%）

大肠杆菌中载体介导转运的证据

1. NCS-2家族同源基因uraA和xanQ敲除株显示：
   • 竞争优势：在5 μg/mL CIP下生长优势
   • 积累减少：30 μg/mL CIP时积累显著降低
2. 磷酸转移酶系统（PTS）基因ptsH/ptsI敲除株：
   • 四环素TET积累显著减少

DISCUSSION
本研究颠覆"抗生素主要靠PLD进入细胞"的传统认知，揭示载体介导转运的普遍性。多重转运冗余解释为何单基因失活仅引起适度表型变化，也说明为何临床很少出现转运蛋白失活导致的耐药。

代谢物模拟的分子逻辑：

• CIP与黄嘌呤结构相似，特异性利用NCS-2而非CNT转运蛋白
• TMP与硫胺素共享转运系统及结构特征
• 莫匹罗星MUP虽与黄嘌呤无直接相似性，但可通过UraA转运蛋白的辅助腔室进入

该发现为抗菌药物设计提供新范式：理性设计代谢物模拟物，利用细菌固有转运系统实现高效递送，突破现有药物穿透细菌膜的开发瓶颈。