囊性纤维化气道中金黄色葡萄球菌NorA/Tet38外排泵的生存机制：抗生素耐药与铜绿假单胞菌共感染的关键因素

本研究揭示囊性纤维化（CF）气道环境中，金黄色葡萄球菌（SA）通过外排泵NorA和Tet38的协同作用抵抗宿主压力与抗生素。人工痰培养基（ASM）实验表明，黏液素激活norA但抑制tet38，而胞外DNA激活tet38但抑制norA（P < 0.05）。铜绿假单胞菌（PA）分泌的群体感应分子PQS、HHQ和吡氰胺（PYO）差异化调控泵表达，且48例CF患者分离株中18.8%为NorA过表达株，其环丙沙星MIC升高≥16倍。62.5%的NorA过表达株携带启动子插入突变（CAAT/ACAA/CTAT），凸显外排泵在SA-PA共感染中的核心适应性机制。

　　

研究内容归纳

引言

囊性纤维化（CF）患者气道因黏液清除障碍形成独特微环境，富含黏液素、胞外DNA等组分，成为机会性病原体如金黄色葡萄球菌（SA）和铜绿假单胞菌（PA）的定植场所。SA常先于PA定植于CF气道，二者共感染加剧抗生素耐药与临床治疗难度。SA的外排泵系统（如NorA和Tet38）除介导抗生素外排外，近年发现其参与抵抗宿主压力及种间竞争，但具体机制未明。本研究通过人工痰培养基（ASM）模拟CF环境，结合临床分离株分析，揭示外排泵在SA适应CF气道及PA共感染中的核心作用。

结果

1. SA依赖NorA和Tet38在ASM中生长
在ASM培养基中，SA野生型（RN6390）生长良好，但缺失株ΔnorA和Δtet38分别出现≥6-log₁₀CFU/mL和≥4-log₁₀CFU/mL的生长缺陷（P < 0.05），而ΔnorC（对照泵）无影响（图1A）。互补实验证实生长缺陷由泵缺失直接导致（图1B）。值得注意的是，ΔnorA在ASM无黏液素时生长改善（缺陷降至3-log₁₀CFU/mL），但在无DNA时仍受限（4-log₁₀CFU/mL）（图1C），表明环境组分通过差异调控外排泵表达影响SA生存。

2. 黏液素与DNA对外排泵的互补调控
qPCR显示：

• 黏液素：在ASM中诱导norA表达（较TSB增加3倍），但抑制tet38（图2A）。
• 胞外DNA：诱导tet38（增加5倍），但抑制norA（图2A）。
  在ΔnorA和Δtet38背景下，另一泵的表达不受影响（图2B-C），证实二者调控独立。这种互补机制使SA能灵活应对CF痰液组分变化：黏液素富集时依赖NorA，DNA富集时依赖Tet38。

3. PA信号分子差异化调控外排泵
PA分泌的群体感应（QS）分子显著影响泵表达：

• PQS：诱导tet38（4倍↑）但抑制norA（图3C）。
• HHQ：同时抑制norA和tet38（2–2.5倍↓）。
• PYO：低浓度（0.04×MIC）诱导norA（2倍↑），但高浓度无影响（图3D）。
  PA临床分离株（如PA-12–PA-15）上清同样诱导tet38（3倍↑），但抑制norA（图3B）。这种调控可能帮助SA在共感染中平衡外排需求：当PQS抑制NorA时，Tet38表达补偿性升高，维持对PA毒素的抵抗。

4. CF临床分离株的外排泵表达特征
48例CF患者SA分离株中：

• 18.8%（9/48）为NorA过表达株：环丙沙星MIC增加≥16倍（8至>128 μg/mL），吡氰胺MIC升高4倍（24 μg/mL）（表1）。
• 10.4%（5/48）为Tet38过表达株：四环素MIC增加4倍（2 μg/mL）。
  启动子测序显示，62.5%（5/8）NorA过表达株携带-10位点插入突变（CAAT/ACAA/CTAT），较其他感染类型显著富集（P = 0.04）。此类突变使norA表达升高6–15倍，且ASM中进一步诱导（图5A），导致环丙沙星MIC额外增加4倍（图5B）。

5. 突变株在CF环境中的适应性
CAAT插入突变株（如CF-25）在ASM中生长与野生型相当，但polX插入（抑制NorA表达）株生长滞后（1-log₁₀CFU/mL缺陷）（图6）。这表明NorA过表达突变可能通过增强ASM适应性在CF气道中富集。值得注意的是，50%的SA-PA共感染株携带CAAT/ACAA/CTAT突变，远高于单独定植株（7.9%），暗示PA压力驱动NorA突变选择。

讨论

本研究建立SA适应CF气道的三重调控网络：

1. 环境组分：黏液素/DNA通过互补调控NorA与Tet38，优化SA在痰液中的生存。
2. 种间互作：PA分泌的PQS/HHQ/PYO差异化调节泵表达，平衡SA对PA毒素的抵抗与代谢成本。
3. 遗传适应：NorA启动子插入突变（CAAT等）在CF临床株中富集，直接导致高水平抗生素耐药。

临床启示在于：CF气道环境及PA共感染可能持续选择外排泵过表达株，加剧SA耐药。靶向NorA/Tet38的双重抑制剂（如天然化合物类似物）或可成为打破SA-PA共感染耐药循环的新策略。未来需深入探究PA信号分子（如PQS）调控SA泵的受体机制及对慢性感染的影响。