乳酸副干酪杆菌突变体糖表型分析：凝集素微阵列技术揭示细胞表面多糖合成基因功能

这篇研究通过构建51个细胞壁多糖合成相关基因的突变株，结合凝集素微阵列（lectin microarray）和单克隆抗体（MAb）技术，系统解析了Lacticaseibacillus paracasei Shirota（YIT 9029）表面多糖（LCPS-1/LCPS-2）的糖基化特征。研究发现cps1基因簇（如cps1A-J）对长链多糖（LCPS-1）合成至关重要，并通过碳水化合物抑制实验验证了甘露糖（Man）和鼠李糖（Rha）特异性凝集素（如rOrysata/CSA）的结合机制。该研究为细菌糖表型（glycophenotyping）与基因功能关联提供了创新方法。

　　

ABSTRACT

研究团队前期发现Lacticaseibacillus paracasei Shirota（YIT 9029）的细胞表面长链多糖（LCPS-1）生物合成基因簇（cps1A-J）可调控免疫细胞细胞因子产生。本研究通过构建51个预测参与细胞壁多糖合成的基因突变株，结合凝集素微阵列技术，系统分析了其表面糖基化特征。结果显示，所有无法结合YIT 9029特异性单克隆抗体（MAb）的突变株均在cps1基因簇内存在缺陷，部分突变株（如cps1F）表现为部分结合能力，提示这些基因可能影响LCPS-1的合成与成熟。

突变体库与抗体反应特征

通过ELISA筛选发现，51个突变株中仅7个（cps1A/B/C/D/E/G/J）完全丧失MAb结合能力，8个（含cps1F）表现为弱结合，其余36个保持野生型（WT）结合水平。值得注意的是，实验室保存菌株YIT 9036/9037也表现为MAb阴性，而YIT 9021/9022则保持部分结合能力。

凝集素结合谱解析

采用含96种凝集素的微阵列分析发现，YIT 9029特异性结合O-聚糖结合蛋白（rDiscoidin II）、甘露糖结合凝集素（rOrysata/rBanana）和鼠李糖特异性凝集素CSA。Δcps1C突变株失去对前三种凝集素的结合能力，但获得对N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）结合凝集素（WGA/LEL/STL）的新亲和性。基因回补实验（Δcps1C/cps1C）证实这些变化完全由cps1C基因功能缺失引起。

糖抑制实验揭示结合特异性

添加1 mM甘露糖（Man）可显著抑制YIT 9029与rOrysata/rBanana的结合，而50 mM鼠李糖（Rha）特异性抑制CSA结合。这与其凝集素特异性一致：rOrysata/rBanana识别Man的C4位羟基，而CSA特异性结合Rha。

cps1基因簇功能异质性分析

10个cps1基因突变株表现出独特的凝集素结合模式：

• cps1A/B/C突变株丧失对rDiscoidin II/rOrysata的结合能力
• cps1D/E突变株获得对rMalectin的新亲和性
• cps1G突变株呈现最广泛的凝集素结合谱（如LFA/RCA120）
• cps1H/I突变株保持WT结合特征

聚类分析将51个突变株分为三类：

1. 仅含Ω0213（eps7I同源物）的Cluster 1：缺失rBanana结合能力
2. 含43个突变株的Cluster 2：保持WT样结合特征
3. Cluster 3：含cps1A-J核心突变株及YIT 9036/9037，均表现为MAb阴性

讨论与应用价值

该研究首次建立细菌糖表型与基因功能的系统关联：

1. cps1基因簇（尤其cps1C）严格调控LCPS-1合成，其缺失导致表面GlcNAc结构暴露
2. 凝集素微阵列可检测到传统抗体无法识别的细微糖结构变化（如Ω0213的Man结合缺陷）
3. 操作单元（如Ω0209-0216）内基因突变株呈现相似结合谱，支持基因功能协同性

这项技术为解析细菌表面糖基化机制提供了新工具，未来可用于：

• 益生菌功能标记开发
• 病原菌表面抗原改造
• 糖基转移酶功能预测

MATERIALS AND METHODS

关键技术包括：

1. 同源重组构建51个突变株（49个插入突变，2个缺失突变）
2. SYTOX Orange荧光标记结合微阵列分析
3. 聚类分析采用Cluster 3.0软件

研究团队特别致谢已故的Toshiaki Osawa教授在凝集素领域的开创性贡献。