莱茵衣藻基因安全港靶向整合实现高表达，萜烯产量提升60倍

语 本研究优化CRISPR/Cas9介导的同源定向修复（HDR）效率，确立50bp同源臂为最佳长度。首次将莱茵衣藻LHCBM1基因座鉴定为基因安全港，其光依赖表达特性使转基因蛋白积累提升8.6倍。应用于萜烯生物合成时，瓦伦烯产量较传统随机整合提高60倍，为微藻细胞工厂开发提供新范式。

　　

文章内容归纳

摘要

传统莱茵衣藻基因工程依赖易错的非同源末端连接（NHEJ），导致转基因表达不稳定。本研究通过优化同源臂长度，实现CRISPR/Cas9介导的精准整合，筛选出LHCBM1基因座作为"基因安全港"。该位点光调控表达特性使转基因蛋白积累量较随机整合提高8.6倍，瓦伦萜合成酶靶向整合后产物产量提升60倍。

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材料与方法

同源臂优化设计
以淀粉合成基因STA6为模型，测试0-300bp同源臂（HA）对HDR效率的影响。电穿孔转染条件：7×10⁷细胞，250V/8ms脉冲，RNP复合物含0.9pmol Cas9蛋白+sgRNA，修复模板750ng。碘淀粉实验筛选编辑效率，PCR验证精确整合。

安全港筛选
选取核糖体蛋白（RPS8、RPL3、RPL10A）、光合基因（RBCS2、LHCBM1）C端作为靶点。构建含FMDV 2A肽的mVenus-aadA融合表达盒，经ChopChop设计sgRNA后转染。Western blot检测核糖体跳过效率，单细胞显微观察定位。

表达分析
RT-qPCR量化内源基因转录（2^-ΔΔCt法），荧光强度/OD₇₅₀表征蛋白表达。瓦伦萜产量通过GC-FID检测两相培养系统（10%十二烷覆盖层）量化。

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结果与讨论

同源臂长度决定HDR效率
50bp HA实现最高编辑效率（27%精确整合），短于10bp或长于100bp显著降低成功率（图1e）。300bp HA导致12%精确整合，伴随28%错误修复。机制上，短HA易降解，长HA易引发非特异重组。

安全港功能验证
■ 靶点适用性：RPL10A、RBCS2、LHCBM1成功整合，RPS8/RPL3因C端修饰影响核糖体功能失败。
■ 转录调控：LHCBM1位点转录提升61±41%，而RPL10A降低72±3%（图2c）。
■ 蛋白分离：FMDV 2A肽实现89-100%切割效率，避免内源蛋白功能干扰（图2d）。

光调控表达特性
■ LHCBM1融合蛋白在15μmol光子·m^-2·s^-1低光下表达最强，高光（350μmol）抑制40%（图3b），符合光合天线蛋白调控规律。
■ 72小时培养中，LHCBM1位点表达强度达随机整合的8.6倍（图3c），且18个月内无沉默现象。

生物合成应用
■ 随机整合瓦伦萜合成酶（CnVs）菌株产量：0.7-2.7mg·L^-1（均值1.3mg·L^-1）。
■ LHCBM1位点整合后产量达3.1±1.0mg·L^-1（最高4.5mg·L^-1），较随机整合提升60倍（图4c），媲美酵母表达系统。

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意义与创新

本研究确立50bp同源臂为莱茵衣藻HDR金标准，解决传统随机整合的位置效应问题。LHCBM1作为首个鉴定的微藻基因安全港，兼具光调控表达优势，为高值萜烯化合物生产提供新平台。融合FMDV 2A肽的策略实现内源基因与外源蛋白协同表达，为真核合成生物学提供通用技术框架。