基于ThresholdR的CITE-seq数据自动去噪方法：提升细胞类型注释与下游分析性能

本文推荐一种新型CITE-seq数据去噪工具ThresholdR，该工具通过高斯混合模型（GMM）自动识别抗体衍生标签（ADT）信号与噪声的阈值，显著优于现有方法DSB和CellBender。研究证实其可降低假阴性率，提升细胞类型注释准确性，并拓展应用于CyTOF数据与样本解复用，为单细胞多组学分析提供可靠解决方案。

　　

引言

CITE-seq技术通过寡核苷酸标记的单克隆抗体（mAbs）在单细胞RNA测序（scRNA-seq）基础上整合细胞表面表型信息，但其抗体衍生标签（ADT）数据存在环境抗体、非特异性结合和滴定误差等技术噪声。传统流式细胞术（FACS）通过设门（gating）和荧光减一对照（FMO）消除噪声，但CITE-seq缺乏类似控制手段。ThresholdR应运而生，通过自动化建模解决这一瓶颈问题。

ThresholdR框架

ThresholdR基于高斯混合模型（GMM）拟合ADT数据的多模态分布，利用期望最大化（EM）算法计算噪声组分参数（均值μ₁和标准差SD），默认以μ₁ + 3SD作为信号/噪声分割阈值。通过贝叶斯信息准则（BIC）选择最优组分数量（K=1-3），避免过拟合。在包含48种抗体的CAVA队列数据中，33种呈双峰分布，15种需三峰拟合（如CD4在单核细胞、CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞中的三峰特征）。

性能验证

在16万例人PBMC数据集（Hao et al.）中，ThresholdR成功去除CD3、CD19等关键标记的非特异性信号。与流式细胞术结果对比显示，其阈值设定与FACS设门高度一致。UMAP可视化显示，去噪后细胞亚群边界更清晰，热图显示噪声信号显著降低。

方法比较

基于流式分选的CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和单核细胞数据集上，ThresholdR的受试者工作曲线（AUC=0.95）远超DSB（AUC=0.73）和CellBender（AUC=0.66）。DSB因强制双峰分布导致单核细胞中CD3假阳性，而CellBender未能消除Fc受体介导的非特异性结合。有趣的是，ThresholdR与CellBender联用可将后者的AUC提升至0.96，形成互补优势。

拓展应用

ThresholdR在质谱流式（CyTOF）数据中成功鉴定B细胞、T细胞亚群和单核细胞亚型（经典、中间、非经典）。在样本解复用（hashtag demultiplexing）中，其性能与CellRanger和Seurat MULTIseqDemux相当。差异表达分析显示，去噪后CD4⁺T细胞的差异基因数量从65增至207，显著提升下游分析灵敏度。

讨论与展望

ThresholdR的创新性在于模拟流式设门逻辑，同时解决环境抗体和Fc结合两类噪声源。其局限性在于可能遗漏罕见细胞群，建议结合转录组再聚类优化。未来可整合加权最近邻（WNN）分析，进一步提升多组学数据整合效果。该工具已开源（GitHub），为单细胞免疫学研究提供标准化解决方案。