综述：Parageobacillus thermoglucosidasius的工程工具箱

这篇综述系统梳理了嗜热菌Parageobacillus thermoglucosidasius（P. thermoglucosidasius）作为工业微生物生产宿主的遗传工程工具箱进展，重点总结了启动子（如Pldh）、核糖体结合位点（RBS）、终止子等调控元件，以及复制型/整合型载体（如pUCG18、pMTL60000系列）和CRISPR-Cas系统（如ThermoCas9）的开发与应用。文章指出该菌在高温发酵中的优势（如减少污染风险），但强调需进一步开发热稳定报告基因（如sfGFP变体）和选择标记（如kanR）以拓展其生物制造潜力。

　　

引言

Parageobacillus thermoglucosidasius作为一种革兰氏阳性嗜热菌，因其60°C的最适生长温度成为可持续化学生产的潜力宿主。相比传统中温宿主（如大肠杆菌），高温发酵可降低冷却成本和杂菌污染风险。尽管其遗传工具开发仍处于发展阶段，现有工具已支持乙醇、核黄素等化合物的生产，但更强大的工程工具箱是工业化应用的关键。

遗传电路元件与载体组件

调控元件：

• 启动子：氧敏感型P_ldh是使用最广的启动子，但半合成启动子库（如基于P_rplS和P_groES的变体）通过sfGFP表达验证了活性范围。木糖（P_xylA）和麦芽糖诱导系统为条件调控提供选项。
• RBS与终止子： Salis实验室RBS计算器设计的合成RBS库（如RBS_pheB）表现出翻译效率差异，而rho非依赖型终止子（如T₅₇₁₈）可精准终止转录。

载体组件：

• 抗生素抗性基因：热稳定卡那霉素抗性基因（kan^R TK101）和壮观霉素标记（aad9）是主要选择工具，但氯霉素抗性（cm^R）因热稳定性较差应用受限。
• 报告基因：改造后的超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP-N39D/A179A）在65°C下稳定，而氧不依赖的β-半乳糖苷酶（BgaB）适用于厌氧条件检测。

质粒载体进展

复制型载体：

• 早期载体pBST22（7.6 kb）被优化为pUCG18（6.3 kb），后者衍生出微型化版本pUCG3.8（3.8 kb）。Reeve等人开发的pG1K（3.7 kb）是目前最小的功能性载体。
• 新型pMTL60000系列引入本土复制起点（pNCI001），支持多质粒共表达系统开发。

整合型载体：

• 经典策略依赖pUB110温度敏感型ori（52°C失活），通过同源重组（HR）筛选突变体。反选择标记（如bgl和pyrE）加速了突变体分离，如pMTL-LS5仅需5天完成编辑。
• 可视化筛选工具（如pMM7携带sfGFP）通过荧光丢失快速识别二次重组子，而Wang等人的双荧光系统（sfGFP/mCherry）进一步优化了筛选流程。

CRISPR-Cas系统应用

• 外源系统：链球菌来源的stCas9.3在pMTL61110载体中实现高效基因敲除，而ThermoCas9（源自P. thermodenitrificans）通过纤维二糖诱导表达。
• 内源系统：Ib型CRISPR-Cas系统兼具编辑和基因沉默功能，配合非同源末端连接（NHEJ）酶可实现长片段随机缺失，但GC含量偏好需通过计算工具优化gRNA设计。

挑战与展望

当前工具箱仍面临转化效率低（需优化甲基化模式）、热稳定元件不足（如缺乏高温适配的荧光蛋白）和选择标记单一等问题。未来方向包括开发无抗生素选择系统（如毒素-抗毒素模块）、挖掘本土调控元件，以及整合转座子或MAGE技术实现多基因编辑。这些改进将推动P. thermoglucosidasius在生物炼制和高温发酵中的工业化应用。