澳大利亚首次检测并溯源葡萄红斑病毒(GRBV)：基于长读长纳米孔测序的流行病学研究

本研究针对葡萄红斑病毒(Grapevine red blotch virus, GRBV)这一全球葡萄栽培业重大威胁，首次在澳大利亚西部通过多重PCR和qPCR检测技术发现其踪迹，并创新性开发基于纳米孔测序的瓦片式扩增子测序(TAS)技术，成功实现病毒全基因组快速测序。研究揭示GRBV可能通过单一引入事件从北美经维多利亚州传入澳大利亚，为制定生物安全应急措施提供了关键分子流行病学依据，对保障价值数百万美元的葡萄酒产业可持续发展具有重要意义。

　　

葡萄产业正面临一个隐形杀手的威胁——葡萄红斑病毒(Grapevine red blotch virus, GRBV)。这种属于Geminiviridae科的环状单链DNA病毒，自2008年在加州首次被发现以来，已导致每公顷高达68,548美元的经济损失。它引发的葡萄红斑病症状与常见卷叶病相似，但传统检测方法难以区分，更棘手的是，病毒在植株内的分布不均匀，使得准确诊断成为行业难题。

澳大利亚西澳大利亚州初级产业与区域发展部(DEPARTMENT OF PRIMARY INDUSTRIES AND REGIONAL DEVELOPMENT, DPIRD)的研究团队在常规病毒监测中，意外发现Manjimup园艺研究所的种质资源库和Wokalup源区的葡萄样本出现异常检测结果。这触发了澳大利亚首例GRBV的全面调查，相关成果发表在《Archives of Virology》。

研究人员采用多管齐下的技术策略：通过常规PCR(引物CPfor/Cprev和GVGF1/GVGR1)和qPCR(引物GRBV-F/GRBV-R)对2128株葡萄进行初筛；针对阳性样本开发创新的瓦片式扩增子测序(TAS)技术，设计13对覆盖全基因组的引物，结合牛津纳米孔MinION测序平台实现快速全基因组测序；运用Nextstrain生物信息学工具构建时间分辨系统发育树，结合贝叶斯推断分析病毒传播路径。样本来源包括西澳两个主要葡萄种质库和维多利亚州CSIRO种质库的历史样本。

首次检测与确认
在Manjimup种质库的Perle de Csaba等8个品种中，通过多重检测方法发现GRBV阳性样本。TAS技术成功获得21条覆盖率59.8%-100%的病毒基因组序列，其中分离株GRBV-WA22-0013的覆盖度达99.72%，平均测序深度3653X。

分子溯源研究
系统发育分析显示澳大利亚所有分离株均属于GRBV进化枝2，与北美株系MF795150具有>99%序列相似性。时间树推测病毒可能通过1969年从加州引入的Perle de Csaba种质传入维多利亚，1985年再传入西澳。

传播风险评估
研究确认澳大利亚尚未发现北美主要传播媒介三齿苜蓿叶蝉(Spissistilus festinus)，但警示需监测其他潜在媒介如Aceratagallia spp.等半翅目昆虫。流行病学模型显示病毒可能通过嫁接材料跨州传播。

这项研究具有三重里程碑意义：技术上，TAS方法将GRBV全基因组测序时间从数周缩短至数天；防控上，及时清除感染植株阻止了病毒扩散；科学上，揭示了GRBV在澳大利亚53年的"潜伏史"。正如通讯作者Monica A. Kehoe强调的，该成果为太平洋沿岸葡萄种植区提供了跨境病毒传播的重要案例，建立的快速检测体系已被纳入澳大利亚植物检疫标准。未来研究将聚焦于本土潜在传播媒介的鉴定及不同葡萄品种的抗性机制探索。