组氨酸构型与位置对三肽分析分离的影响研究及其在药物质量控制中的应用

本研究针对肽类药物合成中组氨酸(His)易发生差向异构化的难题，通过设计8种His构型(L/D)和位置不同的模型三肽(H/hAF、H/hFA等)，系统考察了液相色谱(LC)和毛细管区带电泳(CZE)分离条件(pH、有机溶剂浓度等)的优化策略，建立了灵敏度达0.9 μg·L-1、可检测0.1%差向异构体的LC-UV方法，为药物质量控制提供了高效分析方案。

　　

在生物医药领域，治疗性肽因其高靶向性已成为糖尿病、癌症等疾病的重要治疗手段，市场规模占比超8%。然而肽类药物的合成面临一个关键挑战——氨基酸差向异构化（epimerization），特别是组氨酸（His）因其碱性咪唑侧链，在合成过程中极易发生L型向D型的构型转变。这种微小的立体结构变化可能显著影响药物疗效，欧洲药典甚至要求检测限低至0.1%的杂质。传统分析方法如Marfey法需水解肽链且步骤繁琐，而常规LC-MS/MS无法直接区分对映体，亟需开发高效精准的分析方法。

法国国家科学研究中心（IBMM, UMR 5247）的Ella Tyson团队在《Journal of Chromatography A》发表研究，以含His的三肽为模型，系统探究了氨基酸构型与序列位置对分离分析的影响。研究采用固相肽合成（SPPS）制备了8种仅His构型（L/D）和位置不同的三肽（如HAF/hAF等），通过优化LC和毛细管区带电泳（CZE）的pH、有机溶剂梯度等参数，结合质谱（MS）和Marfey法验证，建立了高灵敏度立体选择性分析方法。

关键技术包括：1）Fmoc-SPPS合成含不同His构型/位置的三肽；2）LC-UV和CZE-UV多条件筛选分离方案；3）LC-MS/MS序列验证；4）Marfey法差向异构化率检测；5）方法学验证（LOD 0.9 μg·L^-1，CV≤0.3%）。

【Peptides synthesis and preliminary characterization】
通过SPPS合成含L/D-His的模型三肽，LC-MS/MS确认序列正确性，Marfey法测得His差向异构化率最低1.8%，证实合成策略有效性。

【Chemicals and materials】
优化色谱条件发现：酸性流动相（0.1% TFA）结合乙腈梯度可将8种三肽完全分离，保留时间差异达2.5分钟，证明His位置（N端/中间/C端）与构型（L/D）均显著影响分离效果。

【CRediT authorship contribution statement】
建立的LC方法检测限（0.9 μg·L^-1）满足欧洲药典0.1%杂质要求，且重复性优异（保留时间CV≤0.3%），显著优于传统偏振光法。

该研究首次系统揭示了His位置对差向异构化速率的影响规律：N端His更易发生构型转变。所建立的LC-UV方法无需手性选择剂即可区分序列相似仅His构型/位置差异的肽，为药物质量控制提供了高效解决方案。这项成果不仅为治疗性肽的合成工艺优化提供了理论依据，其分析方法更可直接应用于工业化生产中的光学纯度监控，具有重要的转化医学价值。