NK-92细胞来源小细胞外囊泡的纯化优化与毒性评估及其sEVs-脂质体杂合系统在药物递送中的应用研究

本研究针对乳腺癌治疗中多药耐药(MDR)和药物脱靶递送问题，开发了基于NK-92细胞来源小细胞外囊泡(NK-sEVs)的新型药物递送系统。研究人员通过超滤联合尺寸排阻色谱(SEC)优化纯化工艺，将sEVs纯度提升至5.13×108颗粒/μg，并创新性地采用冻融、超声和孵育三种膜融合方法构建sEVs-脂质体杂合载体。MTT实验证实该杂合系统对MDA-MB-231细胞的IC50达2.08 mg/mL，为克服传统化疗局限提供了新思路。

　　

在癌症治疗领域，多药耐药(MDR)和药物脱靶效应始终是困扰临床的难题。传统化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，往往对正常组织造成严重损伤，这种"杀敌一千自损八百"的治疗模式严重制约了疗效提升。与此同时，新兴的免疫疗法虽然展现出巨大潜力，但如何实现精准递送仍是待解之谜。正是在这样的背景下，自然杀伤细胞(NK细胞)分泌的小细胞外囊泡(small extracellular vesicles, sEVs)进入了科学家视野——这些直径约100纳米的天然囊泡不仅携带母细胞的杀伤性蛋白，还能穿透生物屏障，堪称理想的"生物导弹"。

Taylor's大学的研究团队在《Journal of Drug Delivery Science and Technology》发表的研究中，开创性地将NK-92细胞来源sEVs与人工脂质体进行杂交融合。他们首先建立超滤-SEC联用的标准化纯化流程，随后系统比较冻融、超声和孵育三种膜融合方法，最终构建出兼具天然靶向性和人工载体稳定性的杂合纳米系统。

关键技术包括：1）采用纳米颗粒追踪分析(NTA)和Western blot表征sEVs粒径及标志物(TSG101/HSP70)；2）通过MTT法测定NK-sEVs对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的半数抑制浓度(IC₅₀)；3）利用荧光标记技术验证杂合载体的细胞摄取效率。研究特别纳入人血小板裂解物(HPL)培养体系，确保临床转化可行性。

【材料与方法】
研究采用ALyS 505NK-EX1000培养基扩增NK-92细胞，通过0.45μm过滤结合100kDa超滤膜初步富集sEVs，再经Sepharose CL-4B色谱柱进一步纯化。Bradford法测定显示SEC处理后蛋白浓度从10.44μg/μL显著提升。

【结果】

1. 细胞毒性验证：显微镜观察显示当NK-92与MDA-MB-231比例达1:2时，肿瘤细胞存活率趋近于零；
2. 囊泡表征：NTA检测超滤分离的NK-sEVs平均粒径为119.1nm，SEC处理后纯度提升13倍；
3. 杂合系统构建：荧光共定位证实冻融法膜融合效率最佳，载药量较天然sEVs提高5倍。

【讨论与展望】
该研究首次证实SEC纯化虽可提高sEVs纯度，但对细胞毒性影响有限(IC₅₀从0.52±0.01降至0.50±0.23mg/mL)。作者建议未来可尝试CAR(嵌合抗原受体)工程技术改造NK-sEVs，或联合PD-1/PD-L1抑制剂增强免疫治疗效果。

这项由马来西亚高等教育部(FRGS/1/2024/SKK06/TAYLOR/03/1)资助的研究，成功搭建了"天然杀伤武器+人工递送平台"的协同系统。正如通讯作者Jhi Biau Foo副教授强调的，这种杂合载体既保留了sEVs的生物学活性，又兼具脂质体的高载药特性，为突破血脑屏障等临床难题提供了全新解决方案。随着冻融工艺的进一步优化，该技术有望成为下一代智能递送系统的标杆。