点击化学介导的肝祖细胞表面多糖功能化增强细胞粘附与移植效果

本研究针对肝细胞移植中细胞粘附率低的难题，创新性地通过代谢寡糖工程（MOE）和点击化学技术，在肝祖细胞（HPCs）表面共价修饰透明质酸（HA）和藻酸盐（Alg）。研究发现HA功能化显著提升HPCs对细胞外基质（ECM）蛋白、内皮细胞及3D肝微组织的粘附能力，同时维持细胞分化潜能，为终末期肝病提供了无需基因修饰的细胞治疗新策略。

　　

肝脏移植是目前治疗终末期肝病的唯一有效手段，但供体短缺严重限制了其临床应用。细胞疗法尤其是肝祖细胞（HPCs）移植被视为潜在替代方案，然而移植后细胞粘附率不足5%的瓶颈问题长期未解。传统基因修饰方法虽能增强粘附，但存在插入突变和异质性表达风险。如何在不改变细胞遗传背景的前提下提升移植效率，成为再生医学领域的重大挑战。

英国伯明翰大学（University of Birmingham）Maria C. Arno团队与跨机构合作者开发了一种基于代谢寡糖工程（MOE）和应变促进炔-叠氮环加成（SPAAC）点击化学的细胞表面工程策略。研究人员选择具有体外扩增优势的HPCs作为模型，通过N-叠氮乙酰甘露糖胺（Ac₄ManNAz）代谢标记将叠氮基团引入细胞表面糖缀合物，再与二苯并环辛炔（DBCO）修饰的多糖（HA/Alg）发生生物正交反应，实现单细胞水平的均质化包裹。关键技术包括：1）优化4天Ac₄ManNAz孵育周期获得最大叠氮表达；2）4℃悬浮条件下2小时点击反应避免非特异性内吞；3）采用微流控芯片模拟生理剪切力下的3D肝微组织（hLMTs）粘附实验。

全细胞多糖涂层构建
通过核磁共振和尺寸排阻色谱确认HA/Alg-DBCO-荧光素（FAM）偶联物的成功合成（补充图1-10）。流式细胞术显示4天Ac₄ManNAz处理可使HPCs表面叠氮表达量达到峰值（图1b）。低温（4℃）反应条件显著降低DBCO-Cy5的非特异性结合（补充图12-13），2小时孵育实现均匀的细胞表面包裹（图1e-f）。涂层在37℃培养条件下72-96小时内逐渐降解（图2a-c），与肝细胞体内移植的关键时间窗吻合。

粘附性能调控机制
定量PCR揭示涂层HPCs的整合素α1/α2/α5/α6/αv和β3/β4/β5亚基表达显著上调（图2d），提示机械转导通路激活。ECM阵列实验显示HA涂层使HPCs对I/II型胶原的粘附率提升92%（图3a），但天然富含HA结合位点的纤连蛋白未见增强。形态学分析表明HA组细胞铺展面积增加、伪足形成活跃，而Alg组因二价离子交联形成刚性微层导致圆形度升高（图3c-d）。在人类脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养中，HA8涂层使粘附细胞比例从42%提升至67%（图3b），且细胞-细胞接触面扩展显著（图3e-f）。

3D微环境下的功能验证
微流控芯片实验证实，在模拟血流的动态条件下，HA4/HA8涂层HPCs在9小时内对hLMTs的粘附量分别增加3.2倍和3.5倍（图4b-c）。Wnt3a诱导分化实验表明涂层不影响HPCs向肝样细胞分化的能力，糖原储存（PAS染色）和白蛋白分泌量（ELISA）与对照组无差异（图4d-e）。

该研究开创性地将生物正交化学应用于再生医学领域，首次证明非遗传性细胞表面工程可同步解决移植细胞的靶向粘附与功能维持两大难题。HA涂层通过双重机制发挥作用：短期内通过多糖-ECM氢键增强初始锚定，长期则依赖整合素上调维持粘附。相较于藻酸盐，透明质酸因其天然存在于细胞外基质的特性展现出更优的生物相容性和促粘附效果。技术层面，悬浮细胞点击反应条件的优化为其他治疗性细胞的表面修饰提供了普适性方案。

这项发表于《Communications Biology》的工作为肝病细胞疗法提供了转化前景明确的新工具：1）避免基因编辑风险；2）与现有移植流程兼容；3）可扩展至其他再生医学应用。未来研究需进一步阐明涂层对细胞免疫原性的影响，并探索胶原、壳聚糖等ECM组分的修饰效果。该技术平台也有望与CAR-T等免疫细胞疗法结合，为实体瘤治疗开辟新途径。