结构解析揭示I类脱水酶MadB底物结合机制及其构象变化对抗菌肽生物合成的启示

本研究针对抗菌肽（lantibiotics）生物合成中关键脱水酶MadB的底物识别机制展开深入探索。研究人员通过冷冻电镜（cryo-EM）首次解析了来自Clostridium maddingley的MadB酶在apo状态和与maddinglicin前导肽（LP）复合物的高分辨率结构，结合ITC、SAXS等技术揭示了底物诱导的β-折叠构象变化（8°旋转）及"调控环"（residues 164-179）的动态调控作用。该研究为理解I类羊毛硫抗生素（class I lantibiotics）脱水酶的底物特异性识别和构象调控提供了分子基础，对开发新型抗耐药菌药物具有重要指导意义。

　　

随着抗生素耐药性危机日益严峻，羊毛硫抗生素（lantibiotics）因其独特的（甲基）羊毛硫氨酸环（(methyl-)lanthionine rings）结构和卓越的稳定性，成为对抗耐药菌的新希望。这类由核糖体合成并经翻译后修饰（RiPPs）的抗菌肽，其生物活性依赖于脱水酶（如MadB）和环化酶（如MadC）的协同作用。然而，I类脱水酶如何特异性识别底物并引发构象变化，始终是制约理性设计新型抗菌肽的关键科学问题。

来自德国海因里希海涅杜塞尔多夫大学（Heinrich Heine University Düsseldorf）的研究团队选择Clostridium maddingley产生的maddinglicin（MadA）作为研究对象，其脱水酶MadB与经典nisin系统的NisB仅有26.8%序列相似性，却具有更复杂的七环结构。通过冷冻电镜技术，研究人员成功捕获了MadB在apo状态（2.7 ?）和与前导肽MadL3复合物（3.1 ?）的高分辨率结构，并结合ITC、SAXS、纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）等多维技术，系统阐明了这一关键酶的分子机制。

研究主要采用以下关键技术：1）冷冻电镜单颗粒分析解析apo-MadB和MadB-MadL3复合物结构；2）等温滴定量热法（ITC）定量测定不同前导肽变体（MadL1-3）的结合亲和力；3）小角X射线散射（SAXS）分析溶液状态下的蛋白质构象变化；4）分子对接（HADDOCK2.4）预测MadB-MadC复合物模型；5）定点突变验证关键结合残基（如"FDLD"基序和VKVK基序）。

MadB的纯化与寡聚状态
SEC-MALS分析显示MadB在溶液中形成249.7 kDa的二聚体（理论值243.6 kDa），与NisB相似。ITC测定发现延长核心肽（CP）区域可显著提高结合亲和力（MadL1 KD=0.41 μM → MadL3 KD=0.15 μM），但维持1:1（二聚体:底物）的化学计量比，暗示CP区域对酶-底物复合物稳定性具有调控作用。

冷冻电镜结构揭示构象变化
比较apo和复合物结构发现，MadB由N端谷氨酰化结构域（GD, residues 1-741）和C端消除结构域（ED, residues 742-1038）组成。最显著的构象变化发生在164-179位残基形成的"调控环"，其旋转8°使RRE（RiPP识别元件）形成四链反平行β-折叠（apo状态为三链），为前导肽结合创造空间。该环在apo状态通过Ser¹⁵⁴-Glu²³⁰-Tyr⁵¹⁸网络稳定，而在结合状态新增与Val^-5/Lys^-6的疏水相互作用，能量学分析显示结合态更稳定。

底物识别机制
电子密度明确解析了前导肽-20到-9位残基（LDDFDLDVKVKA），其中"FDLD"基序（-17到-14位）通过Arg¹⁶¹-Asp^-14、Gln²²⁵-Leu^-15等相互作用锚定在GD，而VKVK基序（-12到-9位）的Lys^-10/Lys^-12分别与Glu¹⁷⁸/Asp⁷⁸⁵形成盐桥。SAXS显示apo-MadB仅在一侧存在通向ED的隧道，而复合物中该隧道消失，支持"单侧结合"模型。突变实验证实"FDLD"基序（MadL2 AAAA突变）对结合至关重要，而VKVK基序（MadL2 VSVS突变）使亲和力降低8倍。

MadBC复合物模型
通过HADDOCK将MadC（PDB 7Q7K）对接至MadB，发现MadC的β-折叠（E³⁹⁶-E³⁹⁷-G³⁹⁸）可能替代"FDLD"基序与MadB的Arg¹⁶¹/Arg¹⁸²相互作用，使前导肽向催化中心移动。该模型支持交替脱水-环化的逐步修饰机制，与nisin系统的N→C方向性修饰一致。

这项研究首次在原子水平揭示了I类脱水酶底物诱导的构象变化，阐明了前导肽与核心肽协同调控酶活性的分子机制。特别重要的是，发现"调控环"的构象变化作为分子开关控制底物通道的开放，这一发现为设计靶向脱水酶的小分子调节剂提供了新思路。研究提出的MadBC复合物模型为理解多酶组装体如何协调脱水与环化反应提供了框架，对开发基于合成生物学的抗菌肽改造策略具有重要指导意义。鉴于MadB与NisB/MibB的结构差异，该研究还暗示不同羊毛硫抗生素系统可能演化出独特的底物识别机制，为探索更丰富的天然抗菌肽库奠定了理论基础。