基于化学标记的细胞蛋白激酶活性分子记录技术：从异质性细胞分选到自由活动小鼠神经调控研究

本研究针对蛋白激酶活性动态监测的技术瓶颈，开发了基于分裂HaloTag和磷酸化依赖分子开关的Kinprola记录系统。研究人员通过设计PKA特异性记录器KinprolaPKA，实现了对异质性胶质母细胞瘤亚群的转录组分析、全基因组CRISPR筛选以及自由活动小鼠神经调制的追踪。该技术将瞬时激酶信号转化为永久荧光标记，突破了传统光学方法的时空限制，为研究激酶活性与细胞表型的关联提供了创新工具。

　　

在细胞信号传导的复杂网络中，蛋白激酶如同分子开关般调控着绝大多数生理过程。当这些激酶的活性发生异常时，往往会导致肿瘤发生和神经功能障碍等严重疾病。然而，现有的激酶活性监测技术面临重大挑战：磷酸化特异性抗体仅适用于固定样本的单时间点检测；荧光报告系统虽能实时监测，但受限于光学穿透深度和组织范围；光遗传学方法KINACT需要持续光照和报告基因表达。这些技术瓶颈严重制约了科学家们在异质性细胞群体和活体动物中研究激酶动态的能力。

来自马克斯·普朗克研究所(Max Planck Institute)的研究团队在《Nature Chemical Biology》发表了一项突破性研究。他们开发了一种名为Kinprola的化学遗传学记录系统，巧妙地将分裂HaloTag技术与磷酸化依赖的分子开关相结合，实现了对蛋白激酶活性的"分子快照"记录。该系统能在特定激酶活性和荧光HaloTag底物存在时快速标记细胞，且标记信号可长期保存，完美解决了传统方法在时空分辨率和检测通量上的局限。

研究采用的核心技术包括：分裂HaloTag系统的蛋白质工程改造、磷酸化依赖的分子开关设计、流式细胞分选技术、全基因组CRISPR筛选，以及活体动物AAV病毒转染和神经活性检测。研究使用的胶质母细胞瘤细胞系S24来自患者源性样本，为研究提供了临床相关性基础。

研究结果部分，"Development of Kinprola"展示了该系统的设计原理。研究人员以蛋白激酶A(PKA)为模型，将截短的环状排列HaloTag(cpHalo△)与FHA1结构域通过PKA特异性底物肽(PKAsub)连接。当PKAsub被磷酸化后，构象变化使Hpep激活cpHalo△的标记活性。优化后的Kinprola_PKA在磷酸化后标记速率提升超过1000倍(k_TMR-CA=1.37×10⁵ M^-1s^-1)，而突变体Kinprola_{PKA_T/A}则无此响应。该系统可使用多种荧光底物，包括TMR-CA、CPY-CA和JF系列染料，并成功在HEK293细胞中记录到forskolin/IBMX诱导的PKA激活。

"Kinprola_PKA recording for transcriptome analysis"部分显示，在胶质母细胞瘤异质性群体中，通过Kinprola_PKA标记分选出的高、中、低PKA活性亚群展现出显著差异的转录谱。GO分析发现682个Kinprola特异性差异表达基因与细胞周期进程显著相关，揭示了PKA活性与肿瘤增殖的潜在联系。值得注意的是，这些基因与钙信号记录器Caprola₆筛选结果仅有部分重叠，表明两种记录器捕获了不同的细胞亚群特征。

在"Kinprola_PKA recording for CRISPR-knockout screening"中，研究团队将Kinprola与全基因组CRISPR筛选相结合，在RKO细胞中鉴定出340个调控PKA活性的基因。其中45个基因敲除降低PKA活性，包括经典通路成员PRKACA、GNAS和ADCY7；295个基因敲除则增强PKA活性。特别值得注意的是FZR1（编码APC/C复合体成员cdh1）的敲除通过影响细胞周期显著提升PKA活性，揭示了细胞周期与PKA信号的新调控机制。

"Recording PKA activation in neurons, brain slices and in vivo"部分证实了该系统在神经系统的广泛应用潜力。在原代海马神经元中，Kinprola_PKA能记录到异丙肾上腺素诱导的β肾上腺素受体激活和电刺激诱发的动作电位。在自由活动小鼠实验中，通过尾静脉注射CPY-CA和腹腔注射D1/D5R激动剂SKF-81297，成功在伏隔核(NAc)中标记到35%的神经元PKA激活，为研究神经调制提供了新工具。

这项研究开发的Kinprola系统代表了激酶活性监测技术的重大突破。其核心创新在于将瞬时生化信号转化为稳定可检测的标记，实现了三个关键突破：首先，通过化学标记替代光学检测，克服了传统荧光报告系统的组织穿透限制；其次，模块化设计使该系统可拓展至PKC、JNK和AMPK等多种激酶；最后，永久标记特性使其适用于后续组学分析和大规模筛选。这些优势使其在基础研究（如神经信号传导机制解析）和转化医学（如肿瘤异质性研究和药物筛选）领域都具有广泛应用前景。特别值得注意的是，该系统能在自由活动动物中记录神经调制事件，为行为学研究提供了全新视角。随着更多激酶特异性记录器的开发，Kinprola技术有望成为研究细胞信号网络的标准化工具。