生物分子凝聚体通过pH缓冲效应增强酶活性的机制研究及其在级联反应优化中的应用

本研究针对酶促反应中pH环境敏感性问题，创新性地利用生物分子凝聚体(Biomolecular condensates)的局部pH缓冲能力，通过构建含嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(BTL2)的酶凝聚体系统，揭示了相分离微环境对酶构象和活性的调控机制。研究发现凝聚体内部可形成比周围溶液更碱性的微环境(pH 8.0)，使脂肪酶在pH 5.0-7.5范围内保持高活性，并成功优化了需不同pH条件的级联反应体系，为生物催化工程提供了新策略。

　　

在细胞这个精密的"化学工厂"中，酶促反应的高效进行离不开精准的微环境调控。传统认知中，细胞通过膜结合细胞器划分不同反应区间，但近年来科学家们发现，无膜细胞器——生物分子凝聚体(Biomolecular condensates)同样发挥着关键作用。这些通过液-液相分离形成的动态结构不仅能浓缩生物大分子，更能创造独特的物理化学微环境。然而，这种微环境如何精确调控酶活性，特别是在维持反应体系pH稳定性方面，始终是未解之谜。

针对这一科学问题，瑞士联邦理工学院苏黎世分校(ETH Zurich)的研究团队以构象依赖性的嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(Bacillus thermocatenulatus Lipase 2, BTL2)为模型，创新性地构建了酶-凝聚体复合系统。研究发现发表在《Nature Communications》的这项工作中，研究人员通过将BTL2与 intrinsically disordered regions (IDRs)融合，成功制备了具有pH缓冲功能的酶凝聚体，揭示了相分离微环境对酶活性的多重调控机制。

研究主要运用了蛋白质工程构建融合酶、荧光探针检测微环境极性(PRODAN)和pH(SNARF-1)、荧光相关光谱(FCS)分析扩散特性、以及酶动力学分析等技术方法。其中特别通过临床相关样本的级联反应验证了系统的实用性。

【Condensation increases lipase enzymatic activity】
研究发现凝聚体内部微环境的极性接近异丙醇，显著促进了BTL2从闭合非活性态向开放活性态的构象转变。通过Lafl-BTL2-Lafl融合蛋白形成的凝聚体将酶浓度提升73000倍(达2.7 mM)，使整体反应速率提高3倍。动力学分析显示凝聚体内k_cat提升至6.9 s^-1，K_M降至334 μM，95%产物在凝聚相内生成。

【Condensates can change the dependence of enzymatic reactions on solution pH】
通过SNARF-1荧光探针首次证实凝聚体内部pH(8.0)高于周围溶液(7.5)。这种pH缓冲效应使BTL2在溶液pH 5.0-7.5范围内均保持高活性，突破了该酶原有最适pH范围(pH 7-9)的限制。DDX4-BTL2-DDX4系统在pH 5.0时的活性比均相系统提高近5倍。

【Biomolecular condensates optimize cascade reactions by local pH buffering】
研究创新性地将这一发现应用于优化需不同pH条件的级联反应。通过将BTL2(最适pH 7-9)与芳香醇氧化酶(AAOx，最适pH 6.0)整合，利用凝聚体维持内部碱性环境同时允许外部保持酸性，使级联反应在pH 6.0时的效率超过pH 7.5条件。

这项研究从分子机制到实际应用系统阐释了生物分子凝聚体作为"智能微反应器"的独特优势：通过局部改变pH等物理化学参数，不仅可扩展酶的最适工作范围，更能实现传统方法难以达成的反应兼容性。特别在需要多酶协同的合成生物学和生物制造领域，这种不依赖物理分隔的微环境调控策略，为复杂生物催化系统的设计提供了全新思路。研究揭示的构象-微环境-活性调控关系，也为理解天然无膜细胞器的功能机制提供了重要参考。