茄科植物醉茄内酯生物合成的保守基因簇发现与代谢工程应用

研究人员针对醉茄内酯（withanolides）药物开发受限于次要成分获取困难的瓶颈问题，通过整合系统基因组学与代谢工程技术，在药用植物睡茄（Withania somnifera）中鉴定出由CYP87G1、CYP88C7、CYP749B2和SDR酶组成的保守生物合成基因簇，并在酵母和本氏烟草中成功重构了关键δ-内酯环的形成途径。该研究为规模化生产结构多样的醉茄内酯提供了分子基础，对开发新型植物源药物具有重要意义。

　　

在传统医学中应用千年的睡茄（Withania somnifera）等茄科植物，其活性成分醉茄内酯（withanolides）具有抗应激、抗肿瘤等广泛药理活性。然而这类甾体内酯化合物的结构复杂性导致其生物合成机制长期不明，特别是决定药理活性的关键δ-内酯环形成途径始终未能解析，严重制约了通过合成生物学手段规模化生产结构多样的醉茄内酯。

德国布伦瑞克工业大学（Technische Universit?t Braunschweig）的研究团队通过高通量测序技术完成了睡茄基因组组装，结合比较基因组学分析发现了一个包含24ISO（Δ²⁴-异构酶）在内的保守基因簇。该基因簇在醉茄内酯生产者中高度保守，而在非生产者中完全缺失，暗示其专一性功能。研究人员创新性地构建了酵母和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）双平台系统：在酵母中通过删除ERG4/ERG5基因并引入植物7RED（Δ⁷-还原酶）和24ISO，将代谢流导向24-甲基去甲胆固醇（2）的合成；在本氏烟草中则通过共表达15个植物甾醇途径基因实现关键前体的高效积累。

主要技术方法包括：1）纳米孔测序结合Hi-C技术完成睡茄染色体水平基因组组装；2）比较基因组学分析9个茄科物种的微共线性；3）酵母CRISPR-Cas9基因编辑构建工程菌株；4）本氏烟草瞬时表达系统实现多基因组合共表达；5）病毒诱导基因沉默（VIGS）验证基因功能。

基因组组装与基因簇发现
通过牛津纳米孔测序获得睡茄2.88Gb基因组（contig N50 71Mb），BUSCO评估显示96.2%的完整性。比较基因组学揭示所有醉茄内酯生产者均存在两个亚基因簇，包含CYP450、SDR（短链脱氢酶/还原酶）等特殊代谢相关基因，且与24ISO保持共线性。表达分析显示这两个亚簇具有差异调控模式。

代谢工程平台构建
在酵母中，工程菌株KMY23通过阻断ERG4/ERG5途径并表达7RED/24ISO，成功积累24-甲基去甲胆固醇（2）（7.6 mg/g DCW）。优化后的KMY54菌株通过调控固醇稳态使产量提升至13.5 mg/g DCW。在本氏烟草中，共表达tHMGR（截短型HMG-CoA还原酶）等15个基因使2的产量达0.9 mg/g干重，且避免了酵母中出现的Δ^5,7,24-三烯固醇（6）副产物。

氧化修饰途径解析
通过异源表达筛选发现：

1. CYP87G1（W22H）催化C-22羟基化，生成(22R)-ergosta-5,24-diene-3β,22-diol（10）
2. CYP88C7（W1H）在C-1位引入α-羟基，形成三羟基中间体14
3. CYP749B2（W26O）与SDR（W26DH）协同完成C-26氧化和内酯环化，产生withanoside V苷元（16）
   VIGS实验证实沉默这些基因会导致睡茄中醉茄内酯含量显著降低（4-22%），并积累相应途径中间体。

该研究首次阐明了醉茄内酯δ-内酯环形成的分子机制，揭示了基因簇在植物特殊代谢进化中的重要作用。建立的酵母-植物双平台不仅解决了醉茄内酯生物合成研究的长期瓶颈，更为开发模块化生产系统奠定了基础，使得通过合成生物学手段获取稀有醉茄内酯成为可能。由于醉茄内酯结构修饰与药理活性密切相关，该发现为基于结构优化的药物开发提供了全新切入点。相关成果发表于《Nature Communications》，为从传统药用植物到现代药物研发搭建了关键桥梁。