高通量底物多重反应平台揭示植物糖基转移酶家族1的广泛催化潜力

植物基因组编码大量功能未知的糖基转移酶（GTs），制约了天然产物多样性的挖掘。加州大学伯克利分校团队开发了一种底物多重反应平台，通过组合筛选85个拟南芥家族1 GTs与453种天然产物的近4万种反应，结合质谱与自动分析，揭示了该酶家族普遍存在的底物混杂性（promiscuity）及其对平面羟基化芳香化合物的偏好性。研究发现UGT73C5可催化127种底物，创植物GT新纪录；同时解析了含非经典Cys-Asp催化二元体的GTs的N-糖基化选择性机制。该平台为大规模酶功能注释、糖苷药物发现及合成生物学提供了通用框架，相关成果发表于《Nature Communications》。

　　

论文解读

植物是天然药物的宝库，其合成的糖苷类化合物在抗癌、抗炎等领域具有重要价值。这些分子多样性主要由家族1糖基转移酶（UGTs）驱动，它们通过催化糖基从尿苷二磷酸糖（UDP-sugar）转移至小分子，改变底物水溶性、稳定性及生物活性。然而，植物基因组中绝大多数UGTs的功能未知，传统“一酶一底物”的研究模式难以应对海量序列数据。据估计，拟南芥中仅15%的家族1 GTs被表征，导致大量糖苷生物合成途径的“暗物质”亟待发掘。这种功能注释滞后严重阻碍了植物代谢通路的解析、高效生物催化剂的开发，以及新型糖苷药物的创制。

针对这一瓶颈，美国能源部联合基因组研究所（Joint BioEnergy Institute, JBEI）与加州大学伯克利分校的研究团队开发了一套创新的底物多重反应平台。研究人员首先构建了涵盖拟南芥14个系统发育分支的85个家族1 GTs的表达文库，利用大肠杆菌裂解液替代纯化酶，显著提升检测通量。关键创新在于将453种天然产物（涵盖42类结构，包括黄酮、香豆素、萜类等）分组为17个底物池（每池40种分子量不重叠的化合物），与单一GT及UDP-葡萄糖（UDP-glucose）共孵育。反应后采用高分辨质谱（LC-MS/MS）检测糖基化产物（单糖基化+162.0533 Da；双糖基化+324.1066 Da），并通过自主开发的自动分析流程，比对实验谱图与MassBank数据库的参考谱，以余弦相似度>0.85为阈值鉴定产物。该方法实现了38,505个反应的高效筛选，较传统策略提升6倍规模。

结果解析

1. 酶功能全景图揭示底物混杂性与化学偏好性
通过大规模筛选，187种（41.3%）底物被至少一种GT糖基化，证实家族1 GTs具有广泛底物兼容性。值得注意的是：

• 高度活跃的底物特征：接受度最高的底物（如芒柄花素、7,2'-二羟基黄酮）均含平面化羟基芳香环（
  
  ）。主惯性矩（PMI）分析显示，GTs偏好棒状/盘状分子（低球形度），与黄酮、香豆素类结构匹配（Fig2d）。
• 超家族特异性效率：黄酮类（30.2%反应阳性）、香豆素类（22.5%）、异黄酮类（22.4%）最易被糖基化，而萜类（<5%）和亲水小分子（如氨基酸）则难以修饰（Fig2e）。
• 酶功能冗余与广谱性：所有85个GTs均具有活性，平均每个酶催化41种底物。UGT73C5以127种底物（29类）成为迄今已知最广谱的植物GT（Fig2f），其活性经纯化酶实验验证（如甘草次酸、紫杉叶素）。

2. 结构基础解释催化广谱性
AlphaFold结构模型显示，UGT73C5的底物结合口袋容积达1600 ?³，显著大于低活性酶（如UGT85A3: 301 ?³）（

）。该口袋由疏水残基（如Phe129, Trp206）围成，可容纳大体积分子（如甾醇类18α-甘草次酸），并通过构象柔性适应不同底物形状（Fig3c）。研究首次证实口袋大小与底物数量呈弱正相关（R²=0.34），提示催化广谱性还受亲疏水性等复杂因素调控。

3. 非经典催化二元体调控N-糖基化选择性
UGT76C1-3和UGT76C5的催化位点以半胱氨酸（Cys）替代经典组氨酸（His）。结构建模表明Cys空间位置与His重叠（

）。突变实验揭示关键机制：

• 化学选择性开关：野生型（Cys-Asp）优先催化细胞分裂素（如6-苄氨基嘌呤）的N-糖基化，而突变体（C20H）则转向O-糖基化（如芒柄花素）（Fig4c）。
• 双残基协同作用：Cys或Asp单一突变为丙氨酸均削弱N-糖基化，表明二者协同稳定过渡态（可能通过硫-芳环作用）。该发现颠覆了“His为O-糖基化必需”的传统认知，为理性设计N-糖基转移酶提供新靶点。

结论与意义

本研究建立了首个可规模化解析植物GT功能的底物多重反应平台，突破了酶功能注释的速率瓶颈。主要科学价值包括：

1. 揭示GT催化规律：发现家族1 GTs普遍具有底物混杂性，且偏好平面羟基芳香化合物，为预测未知GT功能提供结构准则。
2. 发掘超级催化剂：鉴定出迄今最广谱的植物糖基转移酶UGT73C5，其可修饰甾体、萜类等29类分子，为生物制造“通用型”糖基化工具。
3. 解析新催化机制：阐明Cys-Asp二元体通过空间微