高性能PKC活体成像传感器CKAR3揭秘运动皮层神经元信号异质性

针对Gq通路下游PKC活体成像技术瓶颈，研究团队开发了基因编码荧光寿命传感器CKAR3。该传感器动态范围提升10倍，实现秒级响应特异检测，首次在活体动物中揭示运动皮层神经元存在基础PKC活性及运动诱导的mAChR依赖性信号异质性。该工具突破为神经调控机制研究提供了关键技术支持。

　　

研究背景与意义

神经调质通过G蛋白偶联受体(GPCR)调控胞内信号通路，深刻影响大脑功能。尽管G_s和G_i通路成像技术已较成熟，G_q通路下游关键效应分子蛋白激酶C(PKC)的活体动态监测始终面临技术瓶颈。PKC作为G_q信号枢纽，通过磷酸化底物调控神经元兴奋性、突触传递与可塑性，其异常活动与阿尔茨海默病、脊髓小脑共济失调等神经退行性疾病密切相关。然而，现有PKC传感器因动态范围有限（<0.2 ns寿命变化），难以捕捉活体动物行为过程中的微弱信号变化，导致细胞特异性信号异质性研究长期停滞。

研究机构与方法

俄勒冈健康与科学大学(Oregon Health & Science University)的研究团队通过理性设计策略，开发出新一代基因编码PKC传感器CKAR3。关键技术包括：

1. 荧光寿命成像技术(2pFLIM)：利用双光子显微镜结合荧光寿命检测，克服活体成像中光散射、样本漂移对定量分析的影响；
2. 传感器工程改造：基于CKAR2骨架，优化荧光蛋白对（mEGFP/cp-sREACh）及核输出序列，寿命动态范围提升至-0.43 ns（较前代扩大10倍）；
3. 跨尺度功能验证：在HEK细胞、脑切片及活体小鼠中系统评估传感器特异性（PKC抑制剂Go6983消除响应）、动力学（Q₁₀=3.3）及生物兼容性（电生理证实无神经元功能干扰）。

研究结果

1. CKAR3在细胞和神经元中的性能验证

通过平行比较六种现有PKC传感器（图1），发现IDOCKS虽响应最强但需过表达PKC异构酶，而CKAR2具备最佳生物安全性。经三阶段优化（图1e）：(1)采用mTurquoise2提升FRET效率；(2)串联二聚体cpVenus增强能量转移；(3)改用mEGFP/cp-sREACh荧光蛋白对并添加核输出序列，最终获得CKAR3（图1f）。在神经元中，CKAR3对乙酰胆碱（20 μM）的响应幅度达CKAR2的3倍（图3c），且不改变神经元兴奋性、突触传递及慢后超极化电位（sAHP）等关键功能（图3j-l）。

2. 活体基础PKC活性检测

在清醒小鼠运动皮层（M1）、视觉皮层（V1）及小脑VI小叶中，CKAR3寿命值均显著低于非响应突变体（mutCKAR3）（图4b），首次证实皮层神经元存在基础PKC活性。该活性具有区域特异性（M1 > V1 > 小脑）和细胞稳定性（图4c），且30%由毒蕈碱乙酰胆碱受体（mAChR）介导（东莨菪碱使寿命增加0.08 ns，图4d）。

3. 运动行为诱导的PKC动态响应

强制运动范式（图5a）触发M1皮层31%神经元出现PKC响应（图5e），显著高于V1（5%）和小脑（0%）。这些响应神经元可分为两个新功能集群（图5g）：集群1（30%）在运动起始时快速激活（τ_on≈4 s），集群2（70%）呈延迟性多峰响应（图5h-i）。两者动力学相似（τ_off≈14 s，图5j），但均依赖mAChR信号（东莨菪碱抑制90%响应，图5k）。

结论与意义

本研究开发的CKAR3传感器实现了活体神经元PKC活性的高时空分辨率检测，其突破性体现在三方面：

1. 技术性能革新：5倍于现存最佳传感器的动态范围，结合2pFLIM技术，首次解析单细胞水平PKC信号时空动态；
2. 生物学新发现：揭示基础PKC活性的区域异质性及运动诱导的mAChR依赖性神经元集群编码模式；
3. 疾病研究价值：为G_q通路异常相关的神经退行性疾病（如阿尔茨海默病中PKCα活性失调）提供新型研究工具。

该成果发表于《Nature Communications》，不仅填补了神经信号传导工具箱的关键空白，更开创了从分子动力学到行为整合研究的新范式。未来通过结合多通路传感器并行成像，有望解密神经调质对特定信号通路的精确时空调控机制。