枯草芽孢杆菌MgsR依赖启动子结构表征：新型pHIS质粒筛选系统在启动子元素分析中的创新应用

为了解决细菌基因调控中启动子元素贡献分析繁琐的难题，研究人员开发了新型pHIS质粒筛选系统，通过双荧光报告基因（gfp和cfp）实现启动子活性的实时定量监测。研究以枯草芽孢杆菌为模型，验证了Spx操作子功能，并表征了MgsR依赖操作子结构，揭示了上游-35样区域（-35-like region）的沉默作用及MgsR依赖增强子元素的存在。该系统支持RNA聚合酶（RNAP）重新定位模型，为细菌转录调控机制研究提供了通用工具。

　　细菌的生存依赖于精密的基因调控网络，其中转录控制是关键环节。启动子作为转录起始的“开关”，其核心元素（如-35和-10区域）及操作子（operator）的微小变化可显著影响基因表达强度，进而决定细菌对环境压力（如氧化应激）的适应能力。然而，传统方法分析这些元素在体内的作用耗时且繁琐——直接分离和修饰启动子序列在天然背景下困难重重，且缺乏实时监测工具。以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为例，其应激响应机制高度复杂：替代σ因子SigB控制一般应激基因，而次级调控因子如Spx及其旁系同源物MgsR则通过氧化还原敏感开关（CXXC基序）激活特定亚调控网络。尽管Spx的操作子AGCA基序已被阐明，但MgsR的调控机制仍不清晰，这限制了我们对细菌应激适应性的理解。

针对这一挑战，格赖夫斯瓦尔德大学医学中心（University Medicine Greifswald）的研究人员开发了创新型pHIS质粒筛选系统，并通过实验揭示了MgsR依赖启动子的独特结构。研究首先验证了pHIS系统的可靠性：该系统整合gfp（绿色荧光蛋白）和cfp（青色荧光蛋白）双报告基因，以cfp为内参实现实时荧光监测（图1）。随后，聚焦于SigB型启动子，发现MgsR操作子（CAA/TT/A基序）及其上游-35样区域在转录调控中的关键作用。结果表明，MgsR通过重新定位RNA聚合酶，克服沉默元素并激活靶基因，这一模型为细菌转录机制提供了新见解。相关成果发表在《Nucleic Acids Research》，为微生物基因工程和病原体应激响应研究开辟了新路径。

研究人员采用的核心技术包括：1. pHIS质粒构建，通过序列非依赖性克隆（SLIC）组装含复制起点（colE1-ori和pUB110-ori）及双荧光报告基因的载体；2. 启动子元素整合，利用限制性酶切和融合PCR将目标启动子（如ydbD或yocB）插入gfp上游；3. 突变株生成，通过线性DNA片段转化构建ΔmgsR、Δspx和ΔsigB等基因敲除株；4. 体内活性监测，使用荧光激活细胞