微滴微流控技术助力小鼠肠道微生物组的高通量培养与功能解析

本研究创新性地利用微滴微流控（droplet microfluidics）技术，突破了传统培养方法对小鼠肠道微生物组（gut microbiome）研究的限制。通过单细胞封装和独立微环境构建，实现了对难培养菌株的高效分离，并成功追踪饮食干预下的菌群动态变化，为微生物-宿主互作研究提供了新工具。

　　

微滴微流控策略革新肠道微生物研究

ABSTRACT

肠道微生物组的复杂动态及其对宿主健康的影响机制研究，亟需突破传统培养技术的局限。本研究开发的微滴微流控平台，通过将单个微生物细胞封装在皮升级液滴中，构建独立微环境，成功实现了小鼠肠道微生物的高通量培养与分离。与常规琼脂平板法相比，该方法分离出的独特菌株数量显著增加，并能通过16S rDNA扩增子测序反映饮食干预引起的菌群变化。

INTRODUCTION

肠道微生物组作为包含数万亿微生物的复杂生态系统，其失衡与炎症性肠病、代谢紊乱、神经系统疾病等多种疾病密切相关。尽管高通量测序技术已揭示大量未培养微生物的 taxonomic 组成，但传统培养方法在解析微生物生理功能和种间互作方面仍不可替代。微滴微流控技术通过将细胞封装在隔离的微反应器中，避免了营养竞争，为难培养微生物提供了生长机会。此前该技术已成功应用于土壤和人体肠道微生物的分离，例如从多环芳烃污染土壤中分离出降解菌 Blastococcus，以及从粪便样本中培养出平板上无法生长的抗生素耐药菌。

RESULTS

Droplet microfluidic workflow
研究采用四步标准化流程：

1. 小鼠粪便微生物提取与40 μm过滤；
2. 流聚焦微流控芯片生成单细胞液滴（直径55 μm，频率2000滴/秒）；
3. 需氧/厌氧动态培养系统（37°C，3天）；
4. 液滴沉积琼脂平板或16S rDNA测序分析。
   关键创新在于动态培养系统——需氧培养采用循环供氧装置，厌氧培养则在氮气环境中进行，液滴稳定性达数周（体积变化<5%）。

模型菌验证
以粪肠球菌（Enterococcus faecium）和普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）为模型，图像分析显示：

• 需氧条件下粪肠球菌6小时即达生长饱和；
• 厌氧条件下拟杆菌呈现较长滞后期，验证了平台对严格厌氧菌的培养能力。

小鼠肠道菌培养
从粪便样本中分离出40个独特菌株，包括具有益生潜力的加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）和小鼠乳杆菌（Ligilactobacillus murinus）。与传统平板法相比：

• 微滴法获得33个独特菌株；
• 平板法仅获得2株，且均为微滴法已分离菌种。

饮食干预响应
通过蔗糖饮水实验发现：

• 普雷沃菌科（Prevotellaceae）和Akkermansiaceae在粪便和液滴培养中均呈时间依赖性增加；
• 肠杆菌科（Enterobacteriaceae）则呈现下降趋势；
• 液滴培养额外检出2800个粪便中未发现的ASVs，可能源于低丰度菌或孢子态微生物的激活。

DISCUSSION

该技术优势体现在：

1. 克服"平板偏见"：成功培养出 Bacillus 和 Pseudomonas 等常规方法难以分离的菌属；
2. 动态监测能力：通过图像分析量化生长曲线，区分快/慢速生长菌株；
3. 生态相关性：尽管仅使用单一培养基（THB含100 μg/mL制霉菌素），仍能反映饮食干预的菌群变化趋势。

现存挑战包括：

• 严格厌氧菌的氧敏感性：样本处理过程中部分菌株失活；
• 共生依赖菌的局限性：单细胞封装可能不利于依赖群体效应的菌株生长。

未来可通过多培养基整合、厌氧工作站全流程操作、液滴分选等技术进一步优化。该平台不仅为微生物资源库建设提供新方案，更为研究菌群-宿主互作机制开辟了可调控的实验路径。

MATERIALS AND METHODS

关键技术参数：

• 微流控芯片：SU8-2050光刻胶模具，PDMS复制，通道高度50 μm；
• 生长量化：Python图像分析算法计算液滴内生物量占比；
• 测序分析：V3-V4区16S rDNA扩增（引物314F/758R），DADA2流程处理数据。

实验采用C57B/6J小鼠模型，通过抗生素（青霉素+链霉素+多西环素）处理验证了技术对活性菌群的特异性捕获能力。