利用微滴式数字PCR(ddPCR)技术精准定量匍匐剪股颖草屑中币斑病病原菌(Clarireedia spp.)的接种体

本研究创新性地开发了微滴式数字PCR(ddPCR)检测技术，实现了对币斑病病原菌Clarireedia jacksonii在匍匐剪股颖草屑中DNA的绝对定量，灵敏度达1×10?14 g。通过对比四个品种的病原动态，发现抗病品种能显著延缓早期病原积累，为草坪草抗病育种和精准化杀菌剂应用提供了重要技术支撑。

　　

【Abstract】
币斑病由真菌病原体Clarireedia jacksonii引起，是全球冷季型草坪最具经济破坏性的病害。本研究通过开发新型微滴式数字PCR(ddPCR)检测体系，首次实现了对NTEP试验田中三个匍匐剪股颖品种(007XL、Penncross、Oakley)和一个殖民地剪股颖品种(Musket)草屑样本的病原DNA精确定量。该技术无需标准曲线即可检测低至1×10^?14 g的病原DNA，且与田间病害严重度呈显著正相关。

【Plain Language Summary】
研究采用ddPCR技术追踪四个剪股颖品种的病原动态，发现抗病品种能维持较低早期病原载量并延迟症状显现，而感病品种Penncross则呈现双相流行曲线。该技术为草坪育种和病害精准防控提供了新工具。

【Abbreviations】
关键技术指标包括：检测限(LOD)10 fg、定量限(LOQ)100 fg，靶标基因为内转录间隔区(ITS)，采用FAM荧光标记探针。

【1 INTRODUCTION】
匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)作为高尔夫球场关键草种，其币斑病防控年耗大量杀菌剂。传统qPCR检测受标准曲线限制，而ddPCR通过将反应体系分割为20,000个微滴，显著提升对复杂基质中低丰度目标的检测能力。该技术已在Ascochyta、Fusarium等植物病原检测中展现优势，但尚未应用于Clarireedia spp.研究。

【2 MATERIALS AND METHODS】
2.1 实验设计
从马里兰大学NTEP试验田采集4个品种的每周草屑样本(2024年5-8月)，冻干后使用DNeasy Plant Mini Kit提取DNA。

2.2 引物设计
基于ITS区域设计特异性引物，经熔解曲线(84°C单峰)和Sanger测序验证，BLAST显示正向引物仅与C. jacksonii 100%匹配。

2.4 ddPCR流程
采用Bio-Rad QX200系统，反应体系含500 nM引物和250 nM探针。通过泊松统计计算DNA拷贝数/μL，较qPCR减少10倍变异系数。

2.6 病害评估
通过HSV图像分析量化黄化区域百分比，建立与病原DNA量的相关性模型。

【3 RESULTS】
3.1 技术特性
ddPCR在1 fg浓度仍可检出阳性微滴，标准曲线R²=0.9991。与qPCR结果相关性达0.96，但在高浓度区间差异显著。

3.3 品种差异
• Penncross呈现双峰流行：6月13日达1959.5拷贝/μL，7月18日二次峰2120拷贝/μL
• 抗病品种007XL耐受4周高载量(51.5→425拷贝/μL)才显现症状
• 总体相关性：Musket(r=0.89)>Oakley(r=0.66)>Penncross(r=0.54)

【4 DISCUSSION】
ddPCR技术优势体现在：

1. 早期预警：较视觉评估提前2-4周发现病原积累
2. 机制解析：区分抗病性类型(007XL属耐受型，Musket为抑制型)
3. 防控指导：感病品种需重点关注6月、7月两个流行期

研究局限性包括未测试Clarireedia属其他物种交叉反应，且环境因素对流行曲线的影响需进一步量化。该技术未来可整合气象数据，建立病害预测模型，推动草坪病害管理的精准化转型。