西班牙多抗性长芒苋种群分析揭示抗性基因eccDNA从美洲引入的分子证据

这篇研究首次在欧洲证实西班牙长芒苋（Amaranthus palmeri）种群存在对ALS（乙酰乳酸合成酶）和EPSPS（5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶）抑制剂的双重抗性，通过eccDNA（染色体外环状DNA）测序揭示其抗性基因与美国种群完全一致，为抗性基因跨洲传播提供了直接证据。研究揭示了抗性机制包括ALS基因8种靶点突变（含首次报道的Pro-197-Ile）和EPSPS基因扩增（13-123拷贝数），对欧洲农业杂草治理提出严峻挑战。

　　

1 引言
长芒苋作为全球最具威胁的入侵杂草之一，其抗药性进化机制备受关注。研究聚焦西班牙加泰罗尼亚地区两个种群（MB和TA），探究其对ALS抑制剂（噻吩磺隆THIF和咪唑乙烟酸IMA）及草甘膦的多重抗性机制。该物种通过异交繁殖快速传播抗性基因，已在美洲、亚洲等地对9类除草剂产生抗性，而欧洲作为新入侵地，其抗性起源尚不明确。

2 材料与方法
实验采用美国敏感型野生种（WT）为对照，通过剂量反应实验（草甘膦0-3200 g ae ha^-1）和靶基因测序分析抗性特征。关键方法包括：

• ALS基因测序：扩增CAD结构域（引物Ap_3F/Ap_4R）和BE区域（Ap_2F/Ap_2R），检测Pro-197、Asp-376和Trp-574位点突变。
• EPSPS拷贝数测定：qRT-PCR以β-微管蛋白为内参，计算相对拷贝数。
• eccDNA分析：扩增非编码区A/C/E片段（引物eccA_F-R等），比对美国参考序列（NCBI: MT025716.1）。

3 结果
3.1 抗性表型
TA和MB种群对THIF的存活率达57-58%，对IMA为7-25%。草甘膦LD₅₀为285.5-332.6 g ae ha^-1（WT为76.1 g ae ha^-1），抗性系数（RF）达3.7-64.4。序贯处理中，25-33%个体同时耐受草甘膦和THIF。

3.2 ALS抗性机制
共鉴定8种ALS突变类型：

• MB种群：Pro-197-Ser（63%存活个体）、Pro-197-Thr/Asp-376-Glu复合突变（26%）、Trp-574-Leu（5%）。
• TA种群：首次在欧洲发现Pro-197-Ile突变，另检出Pro-197-Ala及Trp-574-Leu（43.5%）。突变个体均为杂合子，暗示多源引入。

3.3 草甘膦抗性机制
所有抗性个体均未检出EPSPS靶点突变（TAP-ITV区），但拷贝数显著增加（13-123倍）。eccDNA测序显示，西班牙种群A/C/E区域（共2500 bp）与美国参考序列100%一致，无SNP差异。

4 讨论
4.1 抗性起源
eccDNA的高度保守性强烈支持抗性基因从美洲引入的假说。这与巴西、乌拉圭等地的研究结论一致，表明该eccDNA可能通过种子传播实现全球扩散。
4.2 管理挑战
研究区域未使用ALS抑制剂，但种群携带丰富ALS突变，提示抗性基因在引入前已进化。气候变暖可能加速长芒苋向北欧扩张，威胁玉米、向日葵等作物。建议建立欧洲联合监测体系，遏制抗性基因扩散。

5 结论
本研究首次揭示欧洲长芒苋多重抗性的分子基础，证实eccDNA跨洲传播假说。Pro-197-Ile等新突变的发现，凸显了加强进口农产品检疫的紧迫性。研究成果为制定抗性治理策略提供了关键科学依据。