苹果中羟基肉桂酰辅酶A双键还原酶(HDR)的鉴定揭示二氢查耳酮合成的多途径机制

这篇研究通过纯化和鉴定苹果叶片中的羟基肉桂酰辅酶A双键还原酶(HDR)，揭示了二氢查耳酮（如根皮苷）生物合成的新途径。研究证实HDR能特异性催化p-香豆酰辅酶A(p-coumaroyl-CoA)还原为p-二氢香豆酰辅酶A，并通过异源表达验证其功能活性。该发现不仅完善了苹果特征性代谢物根皮苷的合成通路，还为植物次生代谢的多样性调控提供了新视角。

　　

摘要

二氢查耳酮作为苹果(Malus ssp.)的特征性次生代谢物，其核心合成步骤——C3桥双键还原机制长期未明。本研究通过优化提取工艺（含10% Triton X-114）从苹果叶片纯化出活性酶，经质谱鉴定为羟基肉桂酰辅酶A双键还原酶(HDR)。该酶属于线粒体trans-2-烯酰辅酶A还原酶家族，能高效催化p-香豆酰辅酶A、阿魏酰辅酶A等底物还原，但不接受游离酸或柚皮素查耳酮。

基因与蛋白特征

HDR基因(MD03G1107400)位于苹果3号染色体，编码含锌结合脱氢酶结构域的377氨基酸蛋白。qPCR显示其在幼叶中表达量最高，且品种间存在差异（‘Pinova’>‘Gala’）。生物信息学预测其N端含线粒体靶向肽(TP)，而实验验证的肽序列覆盖区始于TP切割位点（Ala₃₆），暗示体内可能存在TP切除的活性形式。

异源表达验证

在大肠杆菌中表达截短型MdHDR-ΔN（缺失TP）和全长MdHDR均能催化p-香豆酰辅酶A还原，经CHS/CHI偶联反应生成根皮苷。拟南芥转基因实验表明，表达MdHDR-ΔN的株系中二氢肉桂酸糖苷（如p-二氢香豆酸-4-O-己糖苷）含量显著提升（最高64倍），而根皮苷衍生物未检出，说明宿主缺乏下游代谢通路。

亚细胞定位与异构体

比较基因组学揭示人类和小鼠MECR基因可通过可变翻译起始生成线粒体/胞质双定位异构体。虽然PacBio测序未在苹果中发现类似剪接变异，但机器学习预测mRNA 313位点存在次级起始密码子（Kozak评分0.66），可能产生胞质定位的HDR异构体。

通路讨论

该研究确立了HDR依赖的p-香豆酰辅酶A还原途径（区别于近期报道的柚皮素查耳酮还原酶NCR途径），为解释苹果组织特异性代谢（如果实中NCR低表达）提供依据。HDR的线粒体-胞质双定位假说为亚细胞区室化代谢调控提出新命题，其与脂肪酸合成酶的进化关联也值得深入探索。

应用前景

发现为利用合成生物学在微生物中生产药用二氢查耳酮奠定基础，同时为苹果品质改良（如调控抗氧化成分）提供靶点。研究还提示，植物特殊代谢物的合成可能通过"代谢通道化"实现多途径互补，这为解析天然产物多样性提供了新范式。