溶解微针技术：突破HPV病毒样颗粒稳定性瓶颈，实现多黏膜组织长效无菌保护

本研究创新性开发了一种溶解性微针阵列贴片（D-MAP）平台，通过优化冻干工艺成功保持HPV16 L1病毒样颗粒（VLP）的结构完整性，在室温下可稳定保存6个月。该技术通过颊黏膜给药有效诱导滤泡辅助性T细胞（Tfh）分化、生发中心（GC）形成和高滴度中和抗体产生，同时在口腔和阴道黏膜均实现无菌免疫保护。研究证实该平台能诱导长效免疫记忆，记忆B细胞和浆细胞在组织驻留达6个月，为资源有限地区提供了无需冷链、可自给接种的HPV疫苗新策略。

　　

1 引言
人乳头瘤病毒（HPV）疫苗自2006年问世以来，虽在高收入国家显著降低了宫颈癌等HPV相关疾病发病率，但在中低收入国家（LMICs）仍面临冷链运输成本高、医疗人员不足等挑战。传统微针制备过程易破坏由360个L1蛋白组成的病毒样颗粒（VLP）结构，而VLP的完整性直接影响其通过B细胞受体（BCR）交联激活免疫应答的能力。本研究旨在开发一种能保持VLP稳定的溶解微针（D-MAP）平台，解决疫苗在资源匮乏地区的可及性问题。

2 结果与讨论
2.1 HPV16 VLP D-MAP的制备与表征
通过离心铸造技术制备的16V D-MAP具有21个高度550μm的锥形针尖，在猪皮肤和离体小鼠颊黏膜均显示100%穿透效率。优化后的VLP与海藻糖1:50配比方案，使抗原载量达10μg/贴片，动态光散射（DLS）显示颗粒直径保持121.02±4.7nm，透射电镜（TEM）证实VLP球形结构完整。20分钟应用时间可实现87%抗原递送效率。

2.2 配方稳定性特征
加速稳定性试验（40°C/75%RH）显示，含50倍海藻糖的配方7天后仍维持VLP结构，而对照组出现明显聚集。长期稳定性测试表明，该配方在5°C和25°C下6个月内抗原性稳定，斜率值分别为-1.96和1.7，预示实际保存期可能更长。

2.3 免疫激活机制
Alexa Fluor 647标记实验显示，VLP抗原1小时内即递送至颊黏膜，24小时后在颈淋巴结中检测到荧光信号。流式细胞术证实4%的B细胞成功摄取抗原，包括VLP特异性B细胞亚群。

2.4 体液免疫应答
三剂免疫后，16V D-MAP组诱导的生发中心B细胞（GL7⁺CD95⁺）比例超7%，滤泡辅助性T细胞（PD-1⁺CXCR5⁺）达4%。免疫荧光显示淋巴结中形成明显生发中心结构，颊黏膜中检测到组织驻留记忆B细胞（Brm）和浆细胞。

2.5 中和抗体应答
尽管血清IgG滴度较肌肉注射Gardasil低10倍，但16V D-MAP诱导的中和抗体对HPV16假病毒（PsV）的抑制效果显著。骨髓中检测到持续存在的抗原特异性浆细胞，提示长效保护潜力。

2.6 跨黏膜保护效应
动物攻毒实验显示，颊黏膜免疫对口腔和阴道HPV16 PsV攻击均产生无菌保护。被动血清转移实验证实，20μL免疫血清即可完全中和高剂量病毒，表明保护主要由抗体介导。

2.7 长效免疫保护
6个月后，中和抗体滴度仍保持峰值水平的50%，显著优于肌肉注射组。骨髓ELISpot检测到持续分泌IgG/IgA的浆细胞，口腔攻毒实验显示完全保护效果。

3 结论
该研究建立的D-MAP平台突破了VLP疫苗的稳定性瓶颈，通过颊黏膜给药同时激活系统性和黏膜免疫，且无需专业医疗人员操作。成本分析表明，规模化生产后单价可控制在3.5-4美元，结合其室温稳定性优势，有望成为LMICs地区HPV防控的创新解决方案。未来可扩展至其他依赖结构完整性的VLP疫苗开发。