综述：PRNT的演进：融合传统与创新，树立自动化时代的金标准

这篇综述系统探讨了（PRNT）技术在抗体中和活性检测领域的金标准地位，详细分析了其高灵敏度与特异性优势，同时指出人工操作耗时、结果易受主观影响等局限性。文章重点阐述了自动化技术（如ImmunoSpot、ScanLab等系统）在提升检测通量、标准化数据采集方面的突破性进展，并探讨了机器学习（ML）在病毒斑图像分析中的应用前景。

　　

ABSTRACT
作为中和抗体（nAbs）定量检测的金标准，空斑减少中和试验（PRNT）凭借其高灵敏度和特异性，在血清流行病学研究和疫苗开发中发挥着关键作用。然而，该技术面临操作繁琐、依赖专业人员、人工计数易产生偏差等挑战，这些因素制约了其重现性和实验室间标准化。本文综述了PRNT工作流程自动化的最新进展，探讨了成本与监管框架对技术推广的影响，指出开发适配不同实验室场景的定制化硬件与软件对维持PRNT在免疫评估中的核心地位至关重要。

Plaque reduction neutralization test (PRNT)
1950年代由Dulbecco和Cooper建立的病毒斑技术，通过半固体培养基中形成的溶菌斑来研究病毒特性。如今PRNT已成为检测黄热病、寨卡、登革热乃至SARS-CoV-2等病毒中和抗体的标杆方法。尽管针对SARS-CoV-2的保护性抗体阈值尚未明确，但nAbs定量对疫情监测、免疫评估和疫苗接种策略制定具有重要指导价值，这在COVID-19大流行期间得到充分验证。

The gold-standard limitations
PRNT的瓶颈主要体现在三个方面：首先，6/24孔板格式限制通量，96孔板微量化虽能提升效率但普及不足；其次，实验参数（细胞系、病毒株、孵育时间等）缺乏统一标准；再者，人工计数易受疲劳和主观判断影响。针对黄病毒属等病原体的交叉反应，通常采用四倍滴度差异阈值来区分特异性反应。虽然新兴比色法、流式细胞术等替代方法不断涌现，PRNT仍凭借其不可替代的准确性稳居疫苗临床试验的核心评估手段。

Culture of automation
工业领域早已验证自动化对生产效率的增益，但在生命科学研发中渗透率仍不足。数据显示89%的手工操作存在自动化替代方案，而PRNT正是最需技术改造的典型场景。自动化设备虽初期投入较高，但通过确保数据可追溯性（符合ALCOA+原则）、减少50%以上的实验变异，能显著降低科研不可重复性导致的年均280亿美元损失。

Automation advancements in PRNT
技术革新主要沿三个维度展开：

1. 硬件升级：ImmunoSpot Analyzer通过光学参数配置实现标准化成像；ScanLab系统整合审计追踪功能；IncuCyte?S3无需固定染色即可实时监测细胞病变
2. 微量化改造：黄热病毒微PRNT证明96孔板可使通量提升4倍
3. 智能分析：Plaque2.0和Viridot软件应用机器学习算法，使病毒斑识别准确率较人工提升30%

The state of art for the classic one
技术演进路线图生动展现了从1950年代简易光学显微镜到2023年无透镜全息系统的跨越：

• 1970年代Quantimet? 720首次实现计算机辅助分析
• 2000年代ImageXpress XL引入荧光表型分析
• 2022年机器人臂搭载USB相机的自制系统结合ML算法
• 2023年定量相位成像（QPI）技术实现无标记活细胞监测

伪病毒中和试验（PNA）作为重要补充方案，通过携带报告基因（如荧光素酶）的病毒样颗粒，既保持野生型病毒的中和特性，又能在低生物安全等级实验室开展高通量检测。

Conclusion
PRNT的持续进化需要平衡技术创新与实用性的关系：一方面，模块化自动化设备比尖端技术更易普及；另一方面，AI图像处理虽提升效率但需建立配套监管体系。通过融合微流控、机器学习等跨学科技术，这个拥有70年历史的方法将继续领跑中和抗体检测领域，为疫苗研发和传染病防控提供不可替代的技术支撑。

（注：全文严格基于原文事实，专业术语如PRNT₅₀、TCID₅₀等均按原文格式标注，去除了所有文献引用标记和图表指示符）