基于体外文库开发药物样单域抗体(VHH)的创新策略：优化人源化、稳定性与亲和力的综合研究

这篇研究推荐：本研究创新性地构建了新型VHH（单域抗体）文库，通过整合人源化治疗性支架与经生物信息学优化的互补决定区（CDR）多样性，实现了蛋白A（SpA）结合能力的系统性优化。研究采用酵母展示和噬菌体展示技术筛选出高亲和力（100 pM-10 nM）的VHH分子，并首次对分离的VHH进行了全面的可开发性（developability）评估，为简化抗体药物开发流程提供了重要范式。

　　

摘要

研究团队开发了一种新型VHH（重链单域抗体）文库，通过优化人源化程度、稳定性、亲和力、多样性和可开发性，直接从体外文库中筛选药物样分子。该文库采用四种临床阶段人源化VHH作为支架，插入经生物信息学筛选的人源VH3家族HCDR1和HCDR2序列，并结合来自CD19⁺IgM⁺B细胞的天然HCDR3多样性。通过酵母展示筛选蛋白A结合能力确保正确折叠，最终构建的V1和V2版本文库分别实现了1.6×10⁸的CDR3多样性。

支架选择

从9种治疗性VHH中筛选出4种（caplacizumab、isecarosmab_1、sonelokimab_3、vobarilizumab_1）作为文库支架，其框架区与人类VH3-23基因相似度达82.5%-91.3%。这些支架均保留蛋白A结合能力（无需Fc结构域），且不含骆驼科VHH特有的非经典二硫键。实验验证显示，支架在噬菌体和酵母系统中均能高效展示并保持抗原结合活性。

CDR多样性设计

HCDR1和HCDR2序列源自40名供体的B细胞NGS数据，通过剔除精氨酸富集区、疏水序列等潜在风险位点，最终保留22,062种HCDR1和16,704种HCDR2。单CDR酵母文库经蛋白A磁珠筛选后，CDR1/2与骆驼科天然VHH的氨基酸分布高度相似。HCDR3则直接从人类B细胞中扩增，通过靶向降解JH6基因的连续酪氨酸编码区（RNase H处理），显著减少聚酪氨酸序列（V2文库特性）。

文库性能评估

针对干扰素α-2（IFNa2）的筛选获得72个高亲和力结合体（82-86%结合率），亲和力范围97 pM-15.6 nM。V2文库因热休克筛选（76°C耐受）和酪氨酸去除，表现出更优的可开发性：SEC-HPLC主峰比例提升，SMAC色谱保留时间缩短，且对多反应原（PLE、心磷脂等）的结合率降低。值得注意的是，基于sonelokimab的Lib3在V2中可开发性反降，推测与靶点特异性相关。

可开发性突破

研究首次系统评估了分离VHH（非Fc融合）的理化特性：60% V1和74% V2分子通过可开发性阈值（包括表达量>5 mg/L、Tm>60°C等）。优化组合（V2的Lib1/2/4+V1的Lib3）使77%的抗体兼具高亲和力与低风险特性。蛋白A结合能力的保留使得纯化无需附加标签，显著简化生产工艺。

讨论与展望

相比传统骆驼源VHH，该设计通过人源化支架和CDR的精准匹配，降低了免疫原性风险（临床VHH如caplacizumab的ADA发生率仅8.3%）。尽管人类HCDR3长度（峰值15aa）短于骆驼科（19aa），但避免了长CDR3常见的聚集倾向。未来可探索引入"骆驼化"突变（如V37F/G44E）进一步优化稳定性的潜力。

这项研究为开发"即用型"治疗性VHH提供了新范式，其模块化设计可扩展至双特异性抗体等复杂形式，在肿瘤、自身免疫病和感染性疾病领域具有广阔应用前景。