揭示紫花苜蓿近缘种Medicago edgeworthii中PAT1亚家族基因的鉴定与功能机制：为牧草抗逆育种和细胞再生提供新见解

本研究发现Medicago edgeworthii中9个PAT1亚家族基因（属于GRAS转录因子家族），首次完成该物种全基因组GRAS基因鉴定。通过系统发育（phylogenetic）和表达分析，揭示其保守结构域及在根、茎、叶组织的广泛表达；功能验证表明PAT1激活MeDOF3.4基因，驱动细胞增殖与嫁接（graft）融合，为高寒牧草（Medicago）品种改良奠定理论基础。

　　

Abstract

GRAS蛋白是植物特有的转录因子家族，其中PAT1亚家族在光敏色素（phytochrome）信号通路和胁迫响应中扮演核心角色。本研究首次在Medicago edgeworthii中开展全基因组分析，鉴定出58个GRAS基因，并聚焦于9个PAT1亚家族成员。通过多序列比对，这些蛋白显示保守的C端GRAS结构域和可变的N端区域。表达分析表明，PAT1基因在根、茎、叶中均有表达，功能实验证实其激活MeDOF3.4基因，暗示其在细胞增殖和嫁接融合中的作用。该研究为GRAS基因功能研究和牧草品种改良提供了重要基础。

Introduction

GRAS蛋白家族以最初发现的Gibberellin acid insensitive (GAI)、Repressor of GA1 (RGA)和SCARECROW (SCR)命名，是植物特异性转录因子。典型GRAS蛋白包含400–770个氨基酸，具有保守C端和可变N端，其C端可划分为LHR I、VHIID、LHR II、PFYRE、RVER和SAW等基序。VHIID是所有成员的核心结构，GRAS家族进一步分为DELLA、LAS、SCR、SHR、PAT1、HAM、LISCL和SCL3等8个亚家族。

PAT1亚家族在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中有6个成员（如AtPAT1和AtSCL13），参与光信号转导、非生物胁迫响应和分生组织维持。例如，AtPAT1、AtSCL5和AtSCL21通过N端EAISRRDL基序调控光敏色素A信号，而AtSCL13则在红光信号下影响下胚轴伸长。此外，PAT1基因在嫁接愈合中至关重要，缺失PAT1的拟南芥突变体无法成功嫁接，而过表达则促进愈伤组织形成。PAT1-ERF115复合物对干细胞再生具有关键作用。

DNA结合单指（Dof）家族是另一类植物特有转录因子，其中DOF3.4（或称OBP1）调控细胞周期，并在机械损伤响应中被激活。研究表明，拟南芥中PAT1通过直接激活DOF3.4促进根尖再生。

Medicago edgeworthii是豆科多年生草本，分布于中国高海拔地区（如西藏东南部和青海南部），具有高营养价值和强耐寒性。作为二倍体（2n = 2x = 16），其通过染色体加倍可创制新种质资源，嫁接融合成为改良遗传性状的有效策略。本研究旨在填补该物种GRAS基因研究的空白。

Materials and methods

Plant materials and growth conditions

Medicago edgeworthii植株培养于Murashige & Skoog培养基（含3%蔗糖和0.8%琼脂，pH 5.8），在25/18°C、16小时光照/8小时黑暗条件下生长。取14天苗龄的根、茎、叶组织，液氮速冻后?80°C保存用于RNA提取。

Extraction of DNA and RNA

使用Eastep? Super Total RNA Extraction Kit提取总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳质检后，用5X All-In-One RT MasterMix反转录为cDNA。

Identification of GRAS gene family members and analysis of basic physicochemical properties in M. edgeworthii

基于蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）和拟南芥GRAS蛋白序列（来源：PlantTFDB和TAIR数据库），利用TBtools软件进行本地BLAST（E < 1e^?10, Identity > 40%）。通过Pfam数据库的HMM配置文件（PF03514）和SMART工具验证候选基因，保留含GRAS保守结构域的序列。使用ExPASy服务器计算蛋白分子量（MW）、等电点（pI）、亲水性（GRAVY）和长度；Gpos-mPLoc和NPS-SOPMA预测亚细胞定位和二级结构。

Phylogenetic, gene structure, and motif analysis of GRAS genes

MEGA 7.0进