基于pSIG质粒系统的嵌合双链RNA高效生产新策略及其在灰霉病防控中的应用

本研究针对喷雾诱导基因沉默(SIGS)技术中dsRNA规模化生产难题，开发了MoClo兼容的pSIG载体系统，通过大肠杆菌HT115(DE3)高效生产靶向灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)甾醇合成通路基因的嵌合dsRNA。研究发现Bcerg1单靶点dsRNA比多基因嵌合体具有更强病害抑制效果，为农业病害RNA干扰技术提供了可扩展的实验室生产方案。

　　

在粮食需求激增与农药环境压力并存的背景下，喷雾诱导基因沉默(SIGS)技术因其序列特异性和环境友好特性，成为植物病害防控的新希望。然而，传统体外转录法生产双链RNA(dsRNA)存在成本高、难规模化等瓶颈，严重制约了该技术的田间应用。针对这一挑战，国立中兴大学的研究团队创新性开发了pSIG质粒系统，通过模块化克隆技术实现多靶点嵌合dsRNA的高效生产，相关成果发表于《Plant Methods》。

研究采用Golden Gate克隆构建含双T7启动子的pSIG载体，利用SacB负筛选标记提升克隆效率，通过大肠杆菌HT115(DE3)菌株规模化生产dsRNA。实验选取灰葡萄孢菌甾醇合成(Bcerg1/2/27)、几丁质合成(Bcchs3a/3b/6)和黑色素合成(Bcpks12/13/brn1/2)等12个关键基因靶点，结合生物信息学分析避免人体脱靶效应。

载体构建与效率验证
pSIG1载体通过SacB负筛选实现单片段100%、三片段60%的克隆效率。电泳检测显示IPTG诱导后可稳定产出737bp GFP dsRNA和536bp VDS嵌合dsRNA，每毫升菌液产量达0.19-12.49μg。该系统与MoClo工具包兼容，成功构建含噬菌体裂解基因R的自解质粒plv2-dsErg2-R，冻融循环后释放270bp Bcerg2 dsRNA。

靶点筛选与病害抑制
离体叶片实验表明，靶向甾醇合成基因Bcerg1/2/27的dsRNA使灰霉病斑分别减少34%/19%/20%，RT-qPCR证实基因沉默效率。意外的是，针对Bcerg1(角鲨烯环氧化酶)的270bp单靶点dsRNA抑制效果优于470bp嵌合体Bcergi(含Bcerg1/2/27各150bp)，后者仅使病斑缩小11-18%。研究推测这与Bcerg1在甾醇合成通路中的关键地位及长片段dsRNA摄取效率有关。

技术优势与应用前景
该研究建立的pSIG系统可在4天内完成从质粒构建到dsRNA纯化的全流程，20L发酵规模即可满足百平方米田间试验需求。相比商业体外转录试剂盒，该方案成本降低90%以上，为实验室规模筛选高效靶点提供了实用工具。值得注意的是，针对必需基因的单靶点策略可能比多基因嵌合体更具防控潜力，这对SIGS技术的靶点设计具有重要指导价值。

研究同时揭示了当前技术瓶颈：纯化步骤占成本60%以上，后续可探索细菌裂解液直接施用等简化方案。该成果不仅为灰霉病防控提供了新靶点，其模块化设计思路更可扩展至其他作物病原体，推动RNA干扰技术向实用化迈进。