解码BRCA2基因转录复杂性：基于Hybrid-seq技术揭示乳腺癌和妇科癌症中的新型剪接变异体及其临床意义

本研究通过创新性Hybrid-seq技术（结合纳米孔长读长测序与短读长NGS），系统解析了BRCA2基因在乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌中的转录组复杂性，鉴定出50个新型剪接变异体（BRCA2 sv.7-sv.56）和5个隐蔽外显子（N1-N5），发现19个变异体具有编码潜能，其中sv.9、sv.15等关键变异体在特定癌症中显著表达，为BRCA2相关癌症的分子诊断和靶向治疗提供了新靶点。

　　

在基因组稳定性维护中扮演关键角色的BRCA2基因，其突变与乳腺癌、卵巢癌等妇科恶性肿瘤的遗传易感性密切相关。尽管BRCA2作为重要的肿瘤抑制基因已被深入研究，但其庞大的基因结构（含27个外显子，其中外显子11长达7.4kb）和复杂的转录调控机制，使得科学家们对其转录组多样性的认识仍存在显著空白。传统研究多聚焦于基因突变对蛋白功能的影响，而忽略了替代剪接（Alternative Splicing, AS）这一重要调控层面对癌症发生发展的潜在贡献。这种认知缺口直接制约了我们对BRCA2相关癌症分子机制的全面理解，也限制了基于转录组特征的精准诊疗策略的开发。

雅典大学（University of Athens）的研究团队在《Biochemical Genetics》发表的研究中，采用创新的Hybrid-seq技术策略，成功绘制了BRCA2基因在多种妇科癌症中的完整转录图谱。这项研究通过整合纳米孔长读长测序和Illumina短读长测序的技术优势，克服了传统方法在解析大基因复杂剪接变异时的技术瓶颈。研究人员对11种癌细胞系（包括6种乳腺癌、4种卵巢癌和1种宫颈癌细胞系）进行靶向测序，通过生物信息学分析系统鉴定了BRCA2的新型转录本，并评估了其组织特异性表达模式和潜在功能。

关键技术方法包括：（1）基于基因特异性引物的RT-PCR扩增BRCA2全长转录本；（2）Oxford Nanopore MinION平台进行长读长测序；（3）Ion Torrent PGM平台进行短读长测序；（4）自主研发的ASDT算法进行剪接变异检测；（5）TPM标准化方法定量转录本表达水平；（6）DeepGOWeb工具预测蛋白功能域和基因本体特征。

主要研究结果：

新型BRCA2转录本的发现
研究团队鉴定出50个此前未报道的BRCA2剪接变异体（sv.7-sv.56），显著扩展了该基因已知的转录组多样性。这些变异体呈现出明显的组织特异性表达模式：10个变异体（sv.22-sv.31）为乳腺癌特有，15个（sv.32-sv.46）为卵巢癌特有，而sv.9、sv.15等7个变异体则在多类癌症中普遍存在。特别值得注意的是，通过纳米孔测序直接捕获全长转录本的技术优势，研究人员首次发现了5个隐蔽外显子（N1-N5），这些序列未被常规基因组注释所涵盖，却参与了10种新型转录本的构成。

表达谱特征分析
TPM定量分析揭示了新型转录本与经典转录本的表达差异。虽然所有新型变异体的表达水平均低于主要转录本BRCA2 v.1，但某些变异体如sv.9（乳腺癌和卵巢癌中高表达）、sv.29（乳腺癌特异性高表达）和sv.40（卵巢癌特异性高表达）显示出显著的病理相关性。引人注目的是，标准转录本BRCA2 v.5在所有测试样本中均未检出，暗示其在生理条件下的表达可能具有更严格的调控机制。

功能预测与机制解析
通过计算机模拟分析，19个新型转录本被预测具有完整开放阅读框（ORF），其中sv.13和sv.33编码的蛋白与已知BRCA2异构体（isoform 1和3）完全相同，仅在5'非翻译区存在差异。更关键的是，sv.7、sv.15等变异体编码的蛋白虽然缺失PALB2结合域，但保留了RAD51结合域和DNA结合域（DBD），提示这些异构体可能通过"显性负效应"干扰正常DNA修复功能。基因本体分析进一步显示，多数预测蛋白与经典BRCA2具有相似的亚细胞定位和分子功能特征，但sv.40等变异体在DNA/蛋白结合方面显示出更强的预测信号，可能代表功能获得性变异。

这项研究的重要意义在于：首先，全面揭示了BRCA2基因在癌症中的转录组复杂性，填补了该领域长期存在的知识空白；其次，发现的癌症特异性转录本（如乳腺癌特异的sv.29和卵巢癌特异的sv.40）为开发组织特异性生物标志物提供了新靶点；再者，预测的功能性异构体为理解BRCA2相关癌症的分子机制提供了新视角，特别是那些可能通过显性负效应干扰同源重组修复（HR）的截短型蛋白；最后，建立的Hybrid-seq技术体系为其他大基因的转录组研究提供了可借鉴的方法学框架。这些发现将推动BRCA2相关癌症的分子分型精确化，并为开发基于转录本特异性的靶向治疗策略奠定基础。