新型解脂耶氏酵母底盘菌株的构建及其在工业酶生产中的应用

本研究针对工业酶生产中重组蛋白(rProteins)表达效率低、稳定性差等问题，开发了新一代解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)底盘菌株JMY9438和JMY9451/9452。通过引入三重营养缺陷型标记、删除细菌载体元件及五种胞外蛋白酶基因，显著提高了重组蛋白产量。其中，单拷贝基因在蛋白酶缺陷型菌株中的单位细胞产量最优，为工业酶生产提供了高效表达平台。

　　

在生物技术领域，微生物细胞工厂已成为生产高价值化合物的主力军。其中，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)凭借其强大的代谢能力和环境抗逆性脱颖而出，被广泛用于重组蛋白、有机酸和脂类等生物分子的生产。然而，随着工业需求日益复杂，传统生产菌株暴露出诸多瓶颈：重组蛋白易被胞外蛋白酶降解、多基因操作缺乏选择性标记、诱导系统效率不足等问题，严重制约了工业化应用。

法国农业科学院(INRAE)联合巴黎高科农业学院的研究团队在《Microbial Cell Factories》发表最新成果，通过系统改造解脂耶氏酵母的遗传背景，构建了新一代底盘菌株。研究人员采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，结合分子克隆和表型筛选，成功开发出三重营养缺陷型(ura3/leu2/lys5)菌株JMY9438，并进一步删除过氧化物酶基因HXM1和酸性蛋白酶AXP1。为应对敏感蛋白降解问题，还构建了五重蛋白酶缺陷型菌株JMY9451/9452，缺失了三种Yapsin蛋白酶(YPS3/YPS1/YPS4)和两种细胞壁蛋白酶(PROT3/PROT5)。

关键技术包括：1) 双向导RNA策略实现多基因靶向删除；2) 无细菌元件的ZETA整合平台构建；3) 基于赤藓糖醇诱导的pEYL1-5AB杂合启动子系统；4) 分批培养结合HPLC代谢物分析。

结果部分

Genealogy of strain construction

通过追溯从野生型W29到JMY8647的改造历程，揭示了关键改造节点：初始Po1d菌株通过删除URA3/LEU2建立双重营养缺陷型，随后删除碱性蛋白酶XPR2；MTLY60菌株进一步删除内源脂肪酶LIP2/7/8；JMY7126引入LYS5缺陷和EYK1(赤藓糖醇激酶)缺失，实现诱导系统优化；最终JMY8647删除MHY1抑制丝状生长。

Development of JMY9438

在JMY8647基础上，用无抗生素抗性基因的LEU2-ZETA平台替换原有载体，删除过氧化物酶HXM1和酸性蛋白酶AXP1，获得符合工业标准的JMY9438菌株。测序验证显示所有靶向位点均按设计完成修饰。

Protease-deficient strains JMY9451/9452

通过连续删除五种蛋白酶基因，构建了蛋白水解活性显著降低的衍生菌株。PCR验证证实YPS3/YPS1/YPS4/PROT3/PROT5基因完全缺失，且两个独立克隆(JMY9451/9452)基因型一致。

Proof-of-concept with glucoamylase

以黑曲霉糖化酶(GA)为报告基因测试显示：在YPG培养基中，JMY9438背景的2拷贝菌株(ECY_611)产量最高(100 μM/(mL*h))，但3拷贝菌株出现生长抑制；而蛋白酶缺陷型JMY9451的单拷贝菌株(ECY_619)单位细胞产量比JMY9438提高30%，证明蛋白酶缺失可减少对多拷贝的依赖。

结论与意义

该研究构建的第三代底盘菌株具有三重突破性价值：首先，三重营养缺陷型标记为复杂代谢工程提供了灵活的选择压力；其次，删除细菌DNA元件和抗生素抗性基因符合工业安全生产规范；最重要的是，蛋白酶缺陷背景使敏感蛋白的产量提升不再依赖基因剂量效应。研究还发现，转录因子KLF1对分泌型酶蛋白的增效作用与胞内蛋白不同，提示未来需开发特异性辅助因子。这些改造使解脂耶氏酵母向"即插即用"的工业平台迈进了一大步，为高附加值蛋白药物的生产铺平了道路。