经腹超声引导AAV9-GFP在胎猪体内递送：建立胎儿基因治疗的微创转化模型

本研究针对胎儿基因治疗(IUFGT)的技术瓶颈，开发了一种经腹超声引导的AAV9-GFP递送系统。研究人员通过胎猪模型验证了脐静脉/心内注射scAAV9-CAG-GFP的安全性和有效性，证实该方法可实现多组织转导且不引发显著免疫反应，为先天性单基因疾病的产前干预提供了重要技术平台。

　　

在医学前沿领域，胎儿基因治疗(IUFGT)正掀起一场革命性的浪潮。随着Glybera、Zolgensma等基因疗法相继获批，科学家们逐渐意识到：对于脊髓性肌萎缩等早发型遗传病，出生后干预可能为时已晚——当症状显现时，不可逆的器官损伤往往已经形成。更棘手的是，血脑屏障的发育成熟会阻碍治疗载体进入中枢神经系统，而新生儿免疫系统又可能对治疗载体产生排斥。这些挑战促使研究者将目光投向子宫内的治疗窗口期，但技术瓶颈如缺乏标准化操作方案、安全风险等问题始终制约着临床转化。

在这项发表于《Gene Therapy》的研究中，来自意大利的研究团队另辟蹊径，选择胎猪作为理想模型。猪不仅与人类共享相似的解剖生理特征，其多胎妊娠特点更利于技术验证。研究人员创新性地采用超声引导经腹注射技术，将携带绿色荧光蛋白报告基因的AAV9(scAAV9-CAG-GFP)通过脐静脉或心内途径递送给80-108天胎龄(相当于人类妊娠晚期)的胎猪，系统评估了这种微创方法的可行性。

研究团队主要运用了四项关键技术：超声引导的经腹胎儿注射技术(含脐静脉和心内两种路径)、数字微滴PCR(ddPCR)定量病毒拷贝数、多组织免疫荧光定位GFP表达，以及42重细胞因子阵列分析免疫反应。实验选用4头妊娠母猪，注射剂量范围1.2×10¹²-5×10¹³ vg/kg，最终获得3只转基因阳性存活仔猪和2只转基因阳性死胎。

【Transabddominal ultrasound-guided in-utero injection】

研究建立的超声引导技术平均仅需28分钟即可完成操作，显著低于既往报道的103分钟。通过优化麻醉方案(异氟烷维持)和操作流程，成功避免了Rich团队曾报道的早产问题，仅1例在孕96天(注射后16天)发生早产。胎心监测显示所有受注胎儿均保持正常心率，证实了操作安全性。

【scAAV9 biodistribution and GFP expression】

ddPCR分析显示病毒基因组在胎肝达到21.69±25.7拷贝/二倍体基因组，心肾分别为0.185±0.0775和0.31±0.268拷贝。新生仔猪中，肝脏转导效率最高(31±20拷贝/细胞)，其次是脾肺(约4拷贝/细胞)，而脑组织仅0.113±0.091拷贝。Western blot证实GFP在肝心组织持续高表达，免疫荧光显示其定位于肝细胞、心肌和脑部神经元。

【Assessment of anti-AAV antibody responses】

ELISA检测发现所有实验母猪及仔猪血清均未产生抗AAV9中和抗体，提示胎儿期暴露可避免免疫清除。这一发现对需要重复给药的遗传病尤为重要。

【Evaluating the potential for inflammatory effects】

细胞因子阵列显示仅GM-CSF、GRO-α和IFN-γ轻微上调(1.5-2倍)，组织学分析未发现肝心肾的炎症浸润或纤维化。脑部IBA1(小胶质细胞标记)和GFAP(星形胶质细胞标记)染色显示神经炎症阴性，证实了生物安全性。

这项研究突破了胎儿基因治疗的两大技术壁垒：一是建立标准化的超声引导微创递送方案，手术时间缩短72%；二是首次在猪模型证实AAV9子宫内给药不会诱发母胎免疫反应。尤为重要的是，研究揭示了脐静脉注射与心内注射等效性，为临床路径选择提供了实验依据。虽然一个月后转基因表达有所下降(可能与猪仔快速生长导致的载体稀释有关)，但该模型为线粒体疾病等早发型遗传病的产前干预研究奠定了关键技术平台。正如作者指出，随着罕见病产前诊断技术进步，这种"治未病"的策略有望改写先天性遗传病的治疗范式。