古蛋白质组学突破2100万年界限：早中新世犀科牙釉质蛋白揭示深时系统发育新格局

为突破古蛋白质保存时限的瓶颈（此前记录为370万年前），研究人员针对加拿大高北极地区早中新世（21-24 Ma）犀科化石（Epiaceratheriumsp.）的牙釉质开展古蛋白质组学研究。通过无酶消化提取技术结合高精度质谱分析，成功鉴定7种牙釉质蛋白（包括AMELX, ENAM等）的251个氨基酸序列，获得1,163个肽段谱图匹配（PSMs）。研究证实高纬度寒冷环境可延长蛋白质保存，并利用贝叶斯尖端定年法揭示犀科演化关键分歧（如真板齿犀亚科与犀亚科的分化发生于渐新世），推翻传统"基底分裂"假说，为欧亚动物迁移提供分子证据。

　　

论文解读

背景：深时演化研究的分子困境

分子古生物学长期受限于生物大分子的保存时限。尽管古DNA（aDNA）为更新世生物演化提供了关键证据，但其保存极限仅约120万年（16）。相比之下，古蛋白质在更古老化石中展现出潜力——此前记录来自370万年前北极骆驼化石的骨胶原蛋白（1）。犀科（Rhinocerotidae）作为演化研究中备受争议的类群，其早期辐射历史因分子数据缺失而模糊：传统形态学假说主张真板齿犀亚科（Elasmotheriinae）与犀亚科（Rhinocerotinae）存在"基底分裂"（basal split）（8,9），而基因组研究则暗示较晚的分化时间（31）。解决这一争议亟需更古老的分子证据。

研究设计与技术突破

丹麦哥本哈根大学（University of Copenhagen）Globe研究所领衔的国际团队，聚焦加拿大德文岛霍顿陨石坑（Haughton Crater, 75°N）早中新世（21.8 Ma）地层中的犀科化石（Epiaceratheriumsp., 标本编号CMNFV59632）。研究采用无酶消化古蛋白质组学流程（digestion-free palaeoproteomic workflow）（2,3）提取牙釉质蛋白，利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS） 在Q-Exactive HF-X和Exploris 480质谱仪上分析肽段。通过迭代肽段搜索策略（MaxQuant, PEAKS, MSFragger）构建跨物种牙釉质蛋白数据库，结合热年龄模型（thermal age model）（37）评估保存可行性，并采用贝叶斯尖端定年法（Bayesian tip-dating）在RevBayes软件（50）下构建化石化生灭模型（FBD模型） 分析系统发育。

核心发现

1. 突破性保存证据

   • 从2100万年前的牙釉质中鉴定出7种蛋白（AHSG, ALB, AMBN, AMELX, AMTN, ENAM, MMP20），覆盖251个氨基酸，获得1,163个高置信度肽段谱图匹配（PSMs）。

   • 热年龄计算（基于HadCM3古气候模型（39,40））显示样本等效保存年龄为2.5±2.5 Ma（10°C环境），符合高纬度低温保存预期。

   • 蛋白降解标志物（如精氨酸→鸟氨酸转化、色氨酸氧化）与封闭系统内氨基酸外消旋分析（FAA/THAA比值75%）证实内源性（图2c）。

2. 深时蛋白质的降解特征

   • 与更新世标本（格鲁吉亚德马尼西1.77 Ma犀牛）相比，中新世样本肽段平均长度更短（9.64 vs. 10.42氨基酸），水解程度更高（图2b）。

   • 脱酰胺化（deamidation）率与更新世样本相当，但高级氧化修饰（如组氨酸双氧化+31.99 Da）显著增加（72.3% vs. 6.2%对照）（图2c）。

3. 系统发育关键位点解析

   • 在AMELX蛋白第39位点发现单氨基酸多态性（SAP），谱图验证CMNFV59632保留原始变异（YIDFSYEVLTPLK），区别于其他犀科类群（图3）。

   • 分子钟将CMNFV59632的分歧时间定于中始新世-渐新世（约41-25 Ma），早于真板齿犀亚科与犀亚科的分化节点（约34-22 Ma）。

4. 犀科演化树重构

   • 最大后验树（MAP tree） 显示CMNFV59632位于犀科最基干位置，真板齿犀亚科（Elasmotherium sibiricum）与更新世Stephanorhinus构成姐妹群（图4）。

   • 否定真板齿犀亚科"基底分裂"假说（8,9,29），支持其与犀亚科共同构成单系群（Rhinocerotina），分化晚于Epiaceratherium。

结论与意义

本研究将古蛋白质保存时限推进至2100万年前，拓展了深时分子系统发育研究边界。基于牙釉质蛋白的演化分析表明，霍顿陨石坑犀牛代表早期从欧亚大陆迁入北美的基干犀科类群，其分子证据解决了犀科演化中长期争议：真板齿犀亚科与犀亚科的分化发生于渐新世而非传统认为的始新世深部分裂。这不仅为北极地区作为"古分子化石库"（palaeomolecular lagerst?tte）提供实证，更推动古蛋白质组学与生物地球化学的交叉融合（25,47），为研究古近纪（Palaeogene）生物演化开辟新途径。