双孢蘑菇C2H2锌指蛋白家族全基因组鉴定及表达模式分析揭示其在生长发育中的关键调控作用

本研究针对双孢蘑菇(Agaricus bisporus)中C2H2型锌指蛋白(ZFP)功能未知的科学问题，通过全基因组鉴定技术系统分析了17个AbC2H2基因的理化特性、系统进化和表达模式。研究发现特定AbC2H2成员在菌丝生长(Stage 0)和原基形成(Stage 1)阶段显著上调，揭示了该转录因子家族调控食用真菌形态建成的分子机制，为食用菌遗传改良提供了新靶点。

　　

在食用菌产业中，双孢蘑菇(Agaricus bisporus)以其丰富的营养价值和独特风味占据全球70%的栽培市场份额。然而，这种重要经济作物的生长发育调控机制仍存在大量未知领域，特别是被称为"分子开关"的转录因子家族——C2H2型锌指蛋白(ZFP)。这类含有特征性Cys₂His₂结构域的调控因子，虽然在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中被证实参与多种生命过程，但在食用真菌中的功能图谱仍是一片空白。

浙江农林大学园艺科学学院的研究团队在《BMC Genomics》发表的研究，首次绘制了双孢蘑菇C2H2锌指蛋白家族的完整基因图谱。研究人员采用全基因组扫描技术结合PlantTFDB数据库筛选，从10条scaffold中鉴定出17个AbC2H2基因，通过RNA-seq和qPCR技术解析了这些基因在6个发育阶段(图1)的表达特征，并运用SWISS-MODEL预测了蛋白三维结构。

关键技术包括：1)基于GCA_000300575.1基因组数据的生物信息学筛选；2)MEME工具预测保守基序；3)跨物种系统发育分析(包含 Aspergillus fumigatus 和 S. cerevisiae)；4)不同发育阶段样本的转录组测序；5)实时荧光定量PCR验证。

染色体分布与基因结构
研究发现17个AbC2H2基因不均匀分布在8条染色体上，其中scaffold 5集中了5个基因(图2B)。值得注意的是，与植物中常见的串联复制不同，这些基因未出现成簇分布现象，暗示其进化可能通过片段复制实现。基因结构分析显示，AbC2H2|3、AbC2H2|4等5个基因缺乏UTR区，而AbC2H2|13以952个氨基酸成为家族中最庞大的成员(表1)。

蛋白特征与保守基序
三级结构预测揭示典型的β-β-α折叠构象(图2A)，其中锌离子被Cys和His残基四面体配位。MEME分析鉴定出10个保守基序，Motif 1(C-X₄-C-X₁₂-H-X₃-H)和Motif 2(C-X₂-C-X₁₂-H-X₃-H)存在于除AbC2H2|13外的所有成员中(图2D)。等电点分析显示AbC2H2|3(5.59)、AbC2H2|4(5.54)等6个蛋白呈酸性，其余为碱性(表1)。

表达模式解析
转录组热图(图4A)显示AbC2H2|5、AbC2H2|8等在菌丝生长阶段(Stage 0)表达量最高，暗示其参与营养生长调控。而AbC2H2|12在成熟期(Stage 6)表达持续升高，可能与子实体衰老相关。特别值得注意的是，AbC2H2|8在菌盖贮藏36小时后表达激增，而AbC2H2|14则显著下调，为采后保鲜提供了分子标记。

进化与功能推测
系统发育树(图3A)将AbC2H2分为5个亚家族，其中AbC2H2|8与拟南芥AtYY1同源，后者已知参与ABA信号通路。启动子分析(图3B)发现光响应元件占比最高，解释双孢蘑菇对光照敏感的生物学特性。跨物种共线性分析(图3C)显示与糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)存在8个直系同源基因，表明保守的调控网络。

该研究不仅填补了食用真菌C2H2转录因子研究的空白，更通过表达谱与结构特征的关联分析，为分子育种提供了理论依据。特别是鉴定到的阶段特异性表达基因，如原基形成期活跃的AbC2H2|13，可作为遗传改良的优先靶点。研究揭示的β-β-α结构域保守性，为设计真菌特异性锌指工具提供了结构模板。这些发现将推动食用真菌从传统栽培向精准分子设计的范式转变。