异源三聚体蛋白复合体mRAVE介导后生动物V-ATPase在质子梯度耗散时的组装机制

本研究揭示了DMXL1/2-WDR7-ROGDI组成的mRAVE复合体在V-ATPase组装中的核心作用。研究人员通过CRISPR筛选、冷冻电镜和生化实验证实，mRAVE通过识别V1亚基A/D的失活构象，在溶酶体酸化、神经递质装载和非经典自噬(LC3/ATG8)等过程中发挥关键调控功能，为癫痫性脑病等神经退行性疾病提供了新的分子机制解释。

　　

在真核细胞中，V-ATPase（液泡型ATP酶）如同细胞的"质子泵"，负责维持溶酶体、突触小泡等细胞器的酸性环境。这个由V₁（胞质ATP水解模块）和V₀（膜质子转运模块）组成的分子机器，其组装-解离的动态平衡直接影响神经递质装载、蛋白质降解等关键生理过程。然而，高等生物中V-ATPase的组装机制长期存在谜团——尽管酵母中已知RAVE复合体参与该过程，但哺乳动物中是否存在功能类似物仍不清楚。更引人深思的是，ATP6V0A1等V-ATPase亚基突变与癫痫、骨质疏松等疾病密切相关，提示该系统的调控异常可能导致严重后果。

哈佛医学院（Harvard Medical School）的Christopher Nardone团队在《Nature Structural & Molecular Biology》发表的研究，首次鉴定出后生动物特有的mRAVE（metazoan RAVE）复合体。这个由DMXL1/2、WDR7和ROGDI组成的异源三聚体，通过独特的"天使翅膀"结构（与酵母L形RAVE复合体显著不同），在质子梯度耗散时催化V₁-V₀的精准组装。研究采用全基因组CRISPR筛选锁定WDR7为溶酶体再酸化的关键因子，结合dTAG蛋白降解系统、交联质谱和AlphaFold3建模，揭示DMXL2的螺旋束结构域直接结合V₁的A/D亚基，而单胺类神经递质FFN206的转运实验证实mRAVE缺陷会导致突触小泡功能障碍。

关键技术包括：（1）全基因组CRISPR-Cas9筛选结合LysoTracker流式分选；（2）dTAG13诱导的急性蛋白降解系统；（3）TurboID邻近标记技术定位膜表面蛋白互作；（4）负染电镜与AlphaFold3联合建模；（5）交联质谱验证复合体相互作用界面。

mRAVE是溶酶体酸化和神经递质装载的必要条件
通过BafA1（巴弗洛霉素A1）诱导质子梯度耗散后的再酸化实验发现，WDR7或DMXL1/2的急性缺失会完全阻断溶酶体pH恢复。更巧妙的是，研究人员构建了VMAT2（囊泡单胺转运体2）稳定表达的HEK-293T细胞模型，发现mRAVE缺陷同样会阻碍荧光神经递质类似物FFN206的囊泡装载，这为理解突触传递障碍提供了直接证据。

mRAVE的结构与组装机制
AlphaFold3预测显示，mRAVE呈"天使翅膀"构型：DMXL1/2和WDR7构成两翼，ROGDI作为中心连接器。交联质谱证实DMXL2通过C端螺旋束与V₁的A亚基（ATP6V1A）和D亚基（ATP6V1D）的柔性尾部相互作用。值得注意的是，D亚基C端在活性V-ATPase结构中不可见，暗示mRAVE特异性识别V₁的解离状态。

质子梯度耗散触发超复合体形成
离子载体莫能菌素（monensin）处理诱导mRAVE-V₁-V₀三元超复合体在溶酶体膜表面瞬时组装。TurboID实验显示，WDR7缺失时V₁向溶酶体的募集显著减少，证明mRAVE是膜定位组装的"脚手架"。特别重要的是，V-ATPase抑制剂BafA1虽能阻断质子转运，却无法诱导超复合体形成，提示V₀构象变化是质子感知的关键。

mRAVE调控非经典自噬通路
在质子梯度持续耗散条件下，mRAVE介导的V-ATPase组装会招募ATG16L1，进而启动单膜LC3脂化（CASM/VAIL）。这一发现连接了离子稳态与细胞自噬调控，为理解病原体感染（如流感病毒M2质子通道）或STING激活引发的膜重构提供了机制框架。

这项研究从根本上改变了人们对V-ATPase调控的认知：mRAVE作为后生动物特有的组装因子，其突变（如ROGDI突变导致Kohlschütter-Tonz综合征）可能通过破坏V-ATPase的动态平衡引发神经系统病变。研究提出的"质子梯度-V₀构象-mRAVE招募"三级调控模型，不仅解释了癫痫性脑病等疾病的分子基础，还为开发靶向DMXL2-WDR7相互作用的小分子药物提供了新思路。值得注意的是，与酵母RAVE不同，mRAVE不包含SKP1但新增了WDR7组分，这种进化上的创新可能反映了高等生物对V-ATPase更精细的时空调控需求。