多色荧光共振能量转移技术揭示G蛋白偶联受体FFA1双位点配体协同作用机制

本研究针对G蛋白偶联受体（GPCR）多配体结合机制研究的瓶颈问题，开发了基于双色荧光配体的DISCo-BRET（Dual Interaction Sequential Compound-BRET）技术。通过设计特异性结合FFA1受体两个变构位点的荧光探针TUG-2597（绿色）和TUG-2591（红色），首次实现了对GPCR双配体结合动力学的实时监测。研究发现FFA1位点二配体会显著减缓位点一配体的结合动力学，揭示了变构调控的非对称性特征。该成果发表于《Nature Communications》，为GPCR变构药物开发提供了创新工具。

　　

在药物研发领域，G蛋白偶联受体（GPCR）家族一直是"明星靶点"，约三分之一的上市药物通过调控GPCR发挥作用。然而传统研究主要聚焦于受体单一结合位点，对多配体协同作用的认知仍存在巨大空白。尤其当变构位点（allosteric site）被发现后，科学家们面临一个关键难题：如何实时观测不同位点配体的动态互作？这种互作又如何影响药物效应？

来自丹麦哥本哈根大学（University of Copenhagen）和英国格拉斯哥大学（University of Glasgow）的研究团队另辟蹊径，选择游离脂肪酸受体FFA1（Free Fatty Acid Receptor 1）作为模型。这个与糖尿病治疗密切相关的GPCR具有两个特征明确的变构位点：位点一位于经典正构位点附近，而位点二则藏在跨膜区的脂质界面。研究人员创新性地开发了DISCo-BRET技术，通过精心设计光谱特性匹配的荧光探针，首次实现了对GPCR双配体结合事件的"实时直播"。这项突破性成果发表在《Nature Communications》上，为变构药物研发打开了新视野。

研究主要采用三项关键技术：1）基于结构指导设计位点特异性荧光探针，通过Ca²⁺动员试验和Arrestin-3招募试验验证结合位点；2）建立双色DISCo-BRET检测体系，利用NanoLuc（Nluc）与荧光探针间的级联能量转移监测双配体结合；3）结合动力学分析，通过配体置换实验解析变构调控的时间维度特征。

多色荧光探针的开发
研究首先攻克了位点二荧光探针缺失的难题。以化合物Cpd 6h为模板，通过系统优化连接臂和荧光基团，最终获得高亲和力绿色探针TUG-2597（K_d=350-440 nM）。晶体结构显示其NBD荧光团恰位于膜中部，与C端或N端标记的Nluc均可产生有效BRET信号。对于位点一，研究人员改造已知探针TUG-1460，获得红色SulfoCy5标记的TUG-2591（K_d=23-210 nM），其光谱特性与TUG-2597形成完美级联。

DISCo-BRET技术原理

该技术的核心创新在于利用Nluc→绿色探针→红色探针的级联能量转移。当使用C端标记的FFA1-Nluc时，红色探针必须通过绿色探针"接力"才能接受Nluc能量，从而特异性检测双配体结合事件。光谱扫描证实，加入绿色探针后690 nm处SulfoCy5信号显著增强，验证了级联转移的有效性。

配体药理学特征
通过DISCo-BRET竞争实验，研究人员绘制出FFA1配体结合图谱：位点一激动剂（如TUG-905）能完全竞争红色探针，却增强绿色探针信号；位点二配体（如T360）则部分竞争两种探针。特别值得注意的是PPTQ类拮抗剂，延长芳香环的衍生物TUG-2745选择性地仅竞争位点一，失去了对位点二的变构调控能力，这为设计位点特异性拮抗剂提供了线索。

变构调控的动力学奥秘
动力学实验揭示了令人惊讶的发现：当绿色位点二探针结合时，红色位点一探针的结合速率降低10倍（k_on从1.48×10⁸ M^-1min^-1降至1.44×10⁷ M^-1min^-1），解离速率也相应减缓。而反向实验显示，位点一探针的结合几乎不影响位点二探针动力学。这种单向变构调控暗示位点二配体可能通过稳定特定受体构象，物理性阻碍位点一的配体进出通道。

这项研究不仅建立了GPCR多配体研究的新范式，更揭示了变构调控的复杂本质。DISCo-BRET技术的普适性使其可推广至其他具有变构位点的GPCR研究，而FFA1双位点动力学的发现则为开发精准调控的代谢性疾病药物提供了理论依据。特别在糖尿病领域，能选择性调控特定位点的药物可能实现更精准的血糖控制。该研究标志着GPCR药理学研究从"静态结合"迈向"动态互作"的新阶段，为未来变构药物设计树立了技术标杆。